脉冲染料激光对体外瘢痕成纤维细胞中TGF-β1和TGF-β3表达的影响

陈立新，王莹，林杨杨，管志伟，李钦峰

（天津市儿童医院，天津 300074）

增生性瘢痕发病率高，影响患者面容，甚至导致功能障碍，是当前急需解决的医疗问题之一。近年来，随着脉冲染料激光（Pulsed dye laser，PDL）广泛应用于临床，学者发现其对各种血管性疾病有治疗作用的同时，对增生性瘢痕也有一定的作用。本实验拟通过观察不同能量PDL照射瘢痕成纤维细胞后，转化生长因子（TGF）-β1和 TGF-β3的表达情况，初步探讨PDL治疗增生性瘢痕的机制。

1 材料与方法

1.1 瘢痕成纤维细胞的体外培养 按组织块法行人体瘢痕成纤维细胞的原代培养。将细胞培养于含10%胎牛血清的细胞培养基（DMEM）培养液中，当细胞生长至85%～95%融合时进行传代，第4～10代为实验细胞。传代时，按照每孔2×105～3×105的量接种到96孔细胞培养板中，5%CO2，37℃孵箱中培养16～20 h，待细胞长成致密单层后备用。

1.2 激光照射 激光照射前，将培养液吸出加入PBS缓冲液，用PDL（Cynergy，可序贯发射波长595 nm的强脉冲光，脉冲宽度0.5 ms，发射频率2 Hz，光斑直径为5 mm）单次照射细胞株，以临床常用能量密度 4、6、8、10、11、12 J/cm2，每个能量密度共照射 6 孔（为96孔板每行的中间6孔），并设阴性对照，激光照射时将红纸置于培养皿底部以确定光束作用于全孔。照射后立即弃去磷酸基缓冲液（PBS），将细胞重新置于新鲜的DMEM生长培养液中，37℃、5%CO2培养箱中继续培养24 h。

1.3 流式细胞仪测定不同能量激光照射后成纤维细胞的细胞周期变化 激光照射后24 h收集细胞，4℃下孵育15 min，然后用PBS冲洗2遍，再加入应用碘化丙啶（PI）染色，室温下染色30 min，在流式细胞仪上测定细胞周期。

1.4 激光照射完成后，将培养板移入37℃、5%CO2孵箱，继续培养细胞，24 h后，收集细胞培养液，ELISA法检测不同能量PDL照射后瘢痕成纤维细胞TGF-β1及TGF-β3的表达情况。

1.5 统计学方法 采用SPSS18软件进行分析，各组数值间采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同能量PDL照射后的细胞形态 不同能量PDL照射后，细胞形态未受明显影响，成纤维细胞呈致密单层分布，贴壁、形态良好，分布均匀，可见树枝状结构，提示细胞生长状态良好，见图1。

2.2 流式细胞仪对细胞周期的检测结果表明 不同能量激光照射后，随着能量密度的增加，处于G0/G1期的细胞较对照组明显增多，而S/G2M期的细胞明显减少，见图2。

2.3 不同能量PDL对成纤维细胞TGF-β1表达的影响 不同能量PDL照射后，瘢痕成纤维细胞TGF-β1浓度均下降，与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），总体趋势为能量越高，下降的幅度越明显，见图 3、4。

2.4 不同能量PDL对成纤维细胞TGF-β3表达的影响 不同能量PDL激光照射后，瘢痕成纤维细胞分泌TGF-β3浓度均上升，与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 不同能量PDL激光组照射后细胞形态

图2 PDL对成纤维细胞细胞周期的影响

图3 不同能量PDL照射后TGF-β1浓度变化（能量单位 J/cm2；浓度单位：pg/mL）

3 讨论

PDL是当前应用较为广泛的激光类型之一，有学者发现其对增生性瘢痕也有一定的治疗作用[1-2]，但其具体机制如何尚需进一步研究。增生性瘢痕中成纤维细胞的增殖和活化受多种细胞因子的调控，包括TGF-β、成纤维细胞生长因子（FGF）、结缔组织生长因子（CTGF）、白细胞介素（IL）-6、表皮生长因子（EGF）[3-5]等，其中TGF-β是目前公认与瘢痕形成关系最密切的细胞因子[4]，包括 TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，其中，TGF-β1是一种强有力的趋化因子和刺激剂，可刺激成纤维细胞增殖，加重瘢痕的增生[6]，TGF-β2 与 TGF-β1 的生物活性相同，而TGF-β3则具有抗纤维化作用[7]。

张幸存等[8]通过研究PDL作用于兔耳增生性瘢痕的动物模型发现，595 nm PDL能有效抑制TGF-β1蛋白分泌水平，并最终起到治疗瘢痕的目的。本实验通过体外培养人瘢痕成纤维细胞，观察不同能量PDL作用于人瘢痕成纤维细胞后TGF-β1和TGF-β3的表达情况，分析PDL对增生性瘢痕起治疗作用的机制，以指导临床。结果发现：不同能量PDL照射瘢痕成纤维细胞后，成纤维细胞的增殖受到抑制，G0/G1期的细胞比例明显增高；TGF-β1的分泌量随激光能量的升高而降低，差异有统计学意义，此结论与张幸存等[8]的研究结果一致，而TGF-β3的分泌量则增加，提示PDL治疗增生性瘢痕的机制可能与抑制细胞增殖、降低TGF-β1分泌量提高TGF-β3分泌量有关。

图4 不同能量PDL照射后TGF-β3浓度变化（能量单位 J/cm2；浓度单位：pg/mL）

近年来，随着激光医学的发展，多学科、多位学者已经展开了PDL对增生性瘢痕治疗作用的研究。Bee等[9]通过超声多普勒证实增生性瘢痕内的血管较正常皮肤多，PDL可选择性地破坏瘢痕内的微血管，引起瘢痕可控的有限损伤，刺激机体启动再生修复程序；郭丹凤等[10]在研究PDL治疗充血性瘢痕机理时发现，PDL可抑制小血管的形成并闭合小的血管，加重瘢痕组织的缺氧程度减少生长因子及成纤维细胞来源而治疗瘢痕[11]；Yang等[12]和 Shi等[13]还发现，PDL可通过调节结缔组织生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等其他相关细胞因子的分泌量对瘢痕成纤维细胞增殖进行干预，以达到治疗瘢痕的目的。

增生性瘢痕的形成及治疗受多种因素的影响。本文仅对TGF-β1、TGF-β3进行了初步探讨，由于各种细胞因子有网络性的特点，生物活性之间相互影响，且存在体内与体外实验的差异，完全确定PDL对其他细胞因子、微血管及成纤维细胞的影响，还需更加深入的研究。