FOXA2、E-Cadherin在结肠癌、腺瘤组织中的表达及意义

陈 吉， 李晞璠， 崔 宏， 段 聿， 牛昊书

1.内蒙古医科大学第三附属医院(内蒙古包钢医院)消化内科，内蒙古 包头 014010；2.内蒙古医科大学

结肠癌是一类常见的消化道恶性病变，FEARON等[1]上世纪九十年代提出来结肠腺瘤-腺癌序列的发展模式，现被普遍的接受其发展模式为多基因且多步骤参与形成肿瘤的模式。肿瘤发生与基因水平异常存在一定关系，多见于癌基因-抑癌基因及某些调节因子等的失控，原癌基因被激活而抑癌基因失活[2]。叉头框蛋白A2(forkhead box A2，FOXA2)是FOX家族重要的一员，在维持细胞增殖与凋亡平衡的过程中起着重要的作用是一种新的抑癌基因，对细胞具有调控作用。许多学者认为其与恶性肿瘤密切相关，抑癌基因下调对肿瘤的抑制作用将会降低，肿瘤发生率升高。钙黏蛋白(E-cadherin)本身具有黏附功能，其与细胞的黏附功能密切相关，作为跨膜糖蛋白存在于细胞表面，促进互相之间联接，是与肿瘤分化程度相关的重要蛋白，在一些恶性肿瘤中表达缺失。本实验旨在通过检测FOXA2和E-cadherin mRNA的表达水平探讨二者是否参与了正常结肠黏膜—结肠腺瘤—结肠癌的发展过程及相互的关系及作用机制，从而为结肠癌的早期诊断提供支持，目前未见国内外有相似的研究。

1 资料与方法

1.1一般资料收集内蒙古医科大学第三附属医院2016年1月至2016年12月就诊的消化疾病患者，收集内窥镜结合病理和确诊为正常结肠黏膜30例、结肠腺瘤30例、结肠癌30例。所有患者均以消化道症状入院检查，如慢性腹胀、排便异常，对其进行结肠镜检查并做组织活检。排除标准：家族性腺瘤性息肉史；恶性肿瘤病史；内分泌系统疾病史。根据最终病理结果进行分组，正常对照组30例，男16例，女14例，年龄(49.50±14.01)岁(26～74岁)；结肠腺瘤组30例，男19例，女11例，年龄(58.87±9.92)岁(38～77岁)；结肠癌组30例，男18例，女12例，年龄(65.07±9.72)岁(49～77岁)。

1.2实验方法

1.2.1 标本的采集：在患者知情同意后，与患者签署知情同意书。于结肠镜检查或治疗时，经结肠镜镜下取得活检，于结肠处采集获得，共4块(标本应足够大)。

1.2.2 标本的存放：将标本放入冻存管中，在低温环境下保存(-80 ℃)。

1.2.3 Real-time PCR检测FOXA2和E-cadherin基因mRNA的表达：将超低温冻存的组织样品迅速转移至罗氏匀浆专用带磁珠的管子中，加入500 μl Trizol裂解液；于配套的罗氏匀浆仪中6 500 r/min，震动15 s，反复匀浆3次；取出匀浆管中的上清液，加入0.2 ml的氯仿，离心管中高速离心处理15 s，获得无分层液体，室温环境下放置5 min，12 000×g,10 min；然后取上层水相，加入异丙醇，颠倒离心管使其混合均匀后放置20 min。在4 ℃环境中，12 000×g,10 min，弃去上清液，然后加入1 ml 75%的乙醇，再次4 ℃下12 000×g,离心10 min，倒掉上清液，于23 ℃放置10 min，加入溶解RNA沉淀，然后从得到的溶液中分装出5 μl测定核酸浓度，剩余RNA溶液-80 ℃保存。去除总RNA中的基因组DNA冰上配制反应混合液。反转录需要按照一定条件进行，温度要求为37 ℃，时间要求为15 min，85 ℃、5 s加热，制备完成后暂时不用者可-20 ℃保存备用。经过上述处理后最终获得cDNA，Real-time PCR相对定量检测可以以其为模板进行，最终获得FOXA2和E-cadherin基因mRNA表达状况。

2 结果

2.1FOXA2mRNA在正常结肠黏膜、结肠腺瘤和结肠癌组织中的表达FOXA2 mRNA在三组间呈规律性变化，正常对照组最高，结肠癌组最低，逐渐下降，差异有统计学意义(P<0.001)，结肠腺瘤组和结肠癌组均低于正常对照组的表达，差异有统计学意义(P<0.001)，结肠腺瘤组与结肠癌组相比，差异有统计学意义(P<0.001)(见表1、图1)。

表1 FOXA2 mRNA、E-cadherin mRNA在三种组织中表达的比较Tab 1 Comparison of FOXA2 mRNA and E-cadherin mRNA expression among three tissues

图1 FOXA2 mRNA在三种组织表达的比较Fig 1 Comparison of FOXA2 mRNA expression among three tissues

2.2E-cadherinmRNA在正常结肠黏膜、结肠腺瘤、结肠癌中的表达E-cadherin mRNA在三组间呈规律性变化，其中正常对照组相对较高，结肠癌组表达最低，呈明显变化趋势，差异有显著统计学意义(P<0.001)，结肠腺瘤组和结肠癌组表达均低于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.001)，结肠癌组与结肠腺瘤组比较差异有显著统计学意义(P<0.001)(见表1、图2)。

2.3FOXA2与E-cadherinmRNA表达的相关性正常对照组，FOXA2与E-cadherin mRNA的表达呈正相关(r=0.376，P<0.01)；结肠腺瘤组，FOXA2与E-cadherin mRNA的表达呈正相关(r=0.527，P<0.01)；结肠癌组，FOXA2与E-cadherin mRNA的表达呈正相关(r=0.775，P<0.01)(见图3～5)。

图2 E-cadherin mRNA在三种组织中表达的比较

图3 FOXA2与E-cadherin mRNA在正常结肠黏膜组织中表达的相关性Fig 3 Correlation between FOXA2 and E-cadherin mRNA expression in normal colonic mucosa tissue

图4 FOXA2与E-cadherin mRNA在结肠腺瘤组织中表达的相关性Fig 4 Correlation between FOXA2 and E-cadherin mRNA expression in colon adenoma tissue

图5 E-Cadherin与FOXA2 mRNA在结肠癌组织中表达的相关性Fig 5 Correlation between expression of E-cadherin and FOXA2 mRNA in colon cancer tissue

3 讨论

结肠癌是一种较多发的恶性肿瘤，在消化道恶性肿瘤中最多见。在世界范围内看结肠癌相对多发，与人们的饮食习惯具有一定相关性，随着我国人民饮食结构的变化其在我国的发病率也随之升高，目前已占据第5位[3]，严重威胁着人类的健康。目前结肠癌的诊断主要采用内镜下表现联合病理阅片确诊，其准确率为93%～96%[4]。早期癌内镜下可以根治的病变，而一般结肠癌患者确诊时已达中期甚至晚期，失去了最佳治疗时期[5]。肿瘤的发生和发展受多种因素的影响，且这些因素之间可能存在一定交互作用，研究结果表明，肿瘤的发生与基因突变密切相关。抑癌基因有抑制肿瘤发生、发展的作用，当其发生突变，功能下降或丧失，抑制作用明显减弱，癌变的可能性大幅度增加，肿瘤发生率将会增加。结肠腺瘤是结肠癌的癌前病变，在没有被有效控制的情况下很可能进展为结肠癌，目前结肠癌的发病机理暂不明确。因而分析结肠腺瘤癌变的发病机理有重要意义，可以为此种疾病的治疗提供参考依据。在结肠腺瘤-腺癌序列癌变的过程中，若能够寻找一个有效的分子生物学标志物作为结肠腺瘤早期癌变的诊断依据，将为早期诊断结肠癌及后续的及时治疗提供帮助。

近年来，在分子水平层面对癌症进行研究已经成为热点。正常情况下，内环境的稳定和细胞增殖与细胞凋亡有密切的关系，如果这种平衡被打破，则可引起细胞异常增殖、不受控制，最终导致肿瘤的发生。相关研究[6-10]发现，Notch信号通路和很多肿瘤的发生密切相关，在肠道肿瘤发生中也起到了一定调节作用。当该信号通路处于活性状态后，肿瘤干细胞会大量的增值，而可能导致癌变。Wnt信号传导途径也是近些年行业内的研究热点，学者们认为它与肿瘤发生密切相关，主要关系着细胞发育分化。FOX对胚胎发育可以起到一定的调节作用，相关研究[11]结果表明，此基因在一些食管癌和前列腺癌组织中不表达，是一种新的抑癌基因。目前国内外关于此种基因在结肠癌中的研究较少。敲除FOXA2基因后，小鼠出生后死亡或胚胎死亡，由此获知其影响着内胚层来源细胞，关系着后者的分化与成熟，起着决定性作用[8]。这些细胞在人体较为多见，如出现于肺泡上皮、肝脏细胞等，早期发育即受该基因的影响，FOXA2与晚期分化同样密切相关，从而决定着细胞的最终走向。LIU等[12-13]研究发现，FOXA2表达的缺失可促进肿瘤的发生、发展，其机制主要与肿瘤坏死因子α(TNF-α)作用有关。TNF-α可激活FOXA2，使其下游IKK-α相关位点发生丝氨酸磷酸化，主要反应部位为107和111位点，转录受到影响，活性被抑制，NUMB蛋白表达下调，上述一系列过程使Notch通路激活，细胞增殖速度也会明显的增加，为肿瘤的发生提供了条件。对肿瘤组织中FOXA2进行定量表达检测，同时测定IKK-α与活化Notch1水平，进行相关性分析，结果显示呈正相关，提示其经TNF-α/IKK-α/FOXA2/NUMB/Notch1通路发挥作用，在此过程中炎性反应减弱，促进了肿瘤发生。YAN等[14]认为，FOXA2是发育内胚层过程中关键的转录调控因子，通过Hedgehog信号通路控制以及参与了Wnt信号通路，YU等[15]对前列腺癌进行研究，结果显示，FOXA2具有抑制癌变的功效，通过Wnt/β-catenin信号通路发挥作用，防止瘤变进展，但其作用机理还不明确。本研究结果表明，FOXA2基因的mRNA在正常结肠黏膜组、结肠腺瘤组、结肠腺癌组中的表达呈逐渐下降的趋势，差异均有统计学意义。由此获知FOXA2与结肠癌发生密切相关，本身起到抑癌作用，缺失后会使癌变发生率增加。

E-cadherin是一类介导细胞之间相互黏附的钙依赖性跨膜蛋白，为钙离子依赖黏附分子家族一员。它存在于细胞上皮表面，使其具有极性和完整性，维持形态稳定，进而完成基本细胞功能。如果E-cadherin无法维持正常功能，将很难完成细胞间的有效连接，导致其受到破坏，对肿瘤细胞的约束作用下降，转移随时发生，这是浸润的基础条件[16]。E-cadherin一旦缺乏将会导致细胞间黏附力下降，无法保证其完整性，使得组织极性发生改变。而侵袭和转移是肿瘤细胞的主要行为，肿瘤患者治疗失败与此密切相关。E-cadherin一旦表达缺失，功能下降，必然会导致黏附力不足。肿瘤细胞的侵袭和转移特性基础在于该基因的缺失[17]。E-cadherin对肿瘤还存在抑制作用，主要通过基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的抑制发挥功效，防止蛋白成分降解，抑制肿瘤细胞向周围转移，防止其突破基质，维护后者的屏障功效[18]。LIONI等[19]对E-cadherin进行深入研究，主要针对于其黏附作用进行，认为这一作用对肿瘤细胞同样有效，可以促进区域正常细胞相互之间连接，帮助血管形成，使得肿瘤细胞的迁移能力提高，且侵害作用也增强。本研究结果发现，E-cadherin基因的mRNA在正常结肠黏膜组、结肠腺瘤组、结肠腺癌组中的表达呈逐渐下降的趋势，差异均有统计学意义，与其他学者成果相符合。

相同起源的细胞在某种条件下有可能向其他细胞转化，这是常见的一种生理现象，但在病理条件下同样也会出现，上皮来源细胞可能转化为间质性细胞，即上皮间质转化(EMT)。而相关肿瘤基因研究发现，EMT与侵袭的关系很紧密，恶性肿瘤细胞的迁移能力很强，其与这种细胞转化现象也有一定相关性[20]。肺癌细胞转化生因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)在肺癌转移过程中发挥作用也是通过诱导EMT完成[21]，并进而影响了肿瘤的迁移过程，而FOXA2对癌细胞的抑制作用位点也在于EMT，FOXA2的表达可起到控制侵袭的效果。E-cadherin表达减少或缺失是EMT的重要标志之一[22]。FOXA2一旦缺失，其抑制功能就会受到影响，EMT随之发生，E-cadherin表达下降，FOXA2与E-cadherin具有相关性，前者过表达后者水平将会随之上升[21，23]。EMT时FOXA2对E-cadherin起到调控作用，导致后者表达出现变化，进而发挥功效。二者关系在基因表达中十分明确，FOXA2占据关键性位置，起到决定性作用[24]。肿瘤发生过程中FOXA2发挥抑制性作用，主要针对EMT进行，有研究肯定了在直肠结肠癌中的功效，而在肺癌、胰腺癌等恶性肿瘤中也已明确[25-26]可抑制肿瘤转移。本研究中FOXA2与E-cadherin mRNA在正常结肠黏膜、结肠腺瘤和结肠癌组织中的表达呈正相关，提示FOXA2异常表达可能与E-cadherin基因的表达缺失有关，在结肠腺瘤发展至结肠癌的过程中，发挥了促进作用。