高效液相色谱的维护方法研究

季宏建孙剑华

(1.江苏医药职业学院药学院，盐城 224005；2.盐城市第三人民医院 药学部，盐城 224005)

高效液相色谱法(HPLC)具有其他色谱法无可比拟的优势，具有检测速度快、分离效能高、检测灵敏度高、选择性好、应用范围广等特点[1，2]，广泛应用于食品、药品检测和临床分析等方面[3-5]。流动相、固定相是决定物质能否被高效分离的关键因素。本文从影响流动相和固定相的各因素(物理因素、化学因素)入手，详细研究了高效液相色谱的维护方法。

1 与流动相相关的研究内容

1.1 外部因素(物理因素)对流动相的影响

1.1.1储液瓶

流动相储液瓶是一个简单但很重要的HPLC部件。首先，储液瓶的材质需要对流动相保持惰性。液相用的大部分储液瓶是由玻璃制成，因此实验室的玻璃器皿，厚玻璃瓶等都可以作为储液瓶，但是基于流动相防尘、防污染、防真空等要求，必须提供为液相色谱特殊设计的储液瓶。储液瓶需要用盖子之类的物品保护，免受灰尘的污染，以及减少流动相的挥发。但同时盖子也不能盖得太紧，否则在流动相泵出时易产生容器内真空，导致断流。

1.1.2过滤

如果HPLC系统中存在颗粒杂质，那么系统的比例阀、单向阀、管路、色谱柱、进样阀等都无法良好运行，并会导致磨损，因此，使用没有颗粒杂质的流动相是基本要求。市售的HPLC级的溶剂和实验室准备的HPLC级别水，使用前要通过0.45μm 或0.22μm的微孔滤膜过滤。流动相中加入了其他组分(例如缓冲盐、离子对试剂等)，也是必须要过0.45μm 或0.22μm的微孔滤膜的。

1.1.3脱气

只要空气在流动相里保持溶解，气泡问题就很少会出现，但若是被气体饱和的溶液，只要非常小的压力下降就能导致气泡逸出。以纯水和纯甲醇为例，若它们被暴露在空气中，就会分别被空气饱和，而空气在甲醇/水混合溶剂里面的溶解度与甲醇浓度有关，低于其在甲醇和水中溶解度之和，当两种溶剂混合后，混合液中气体会过饱和，便迅速以气泡形式逸出。因此，为了增加HPLC操作的可靠性，必须以适当的方法(超声波脱气、过滤脱气、在线脱气等)对流动相脱气。

1.1.4保存期限

配好的流动相都有一定的保存期限，因此为避免流动相变质而导致浪费，建议根据实际实验情况和有效期，合理配制一次所需的用量。在将配制好的新鲜流动相倒入储液瓶前，需先将储液瓶润洗3次。然后把填写好的《储液瓶标签》(内容包括流动相成分、配比、配制人、配制日期及有效期等信息)粘贴到储液瓶上。

1.2 内部因素(化学因素)对流动相的影响

1.2.1pH值的影响

流动相的pH值应控制在2～7之间。当pH值大于7时可使硅胶载体溶解；当pH值小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。当色谱系统中需使用pH值大于7的流动相时，应选用耐碱的填充剂；当需使用pH值小于2的流动相时，应选用耐酸的填充剂。

1.2.2缓冲盐的水相溶液的影响

含有缓冲盐的流动相应尽可能少用，必须使用时，缓冲盐的浓度应尽可能低，否则容易阻塞管路。由于十八烷基链在纯水相溶液中易产生弯曲，所以对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中水相溶液的比例通常应低于95%，否则C18链的随机弯曲将引起组分保留值变化，导致色谱系统的重现性很差。

1.2.3流动相的组成比例、变化幅度的影响

流动相的成份不能随意改变，但是比例可适当调整。每次调整流动相组成比例时，以组分比例较低者(小于或等于50%)相对改变量不超过±30%且绝对改变量不超过±10%为宜，如40%相对改变量的数值超过30%时，则绝对改变量以±10%为宜。

2 与固定相(色谱柱)相关的研究内容

2.1 影响色谱柱使用寿命的原因

2.1.1色谱柱筛板问题

筛板位于色谱柱的入口处，容易发生堵塞。筛板堵塞会产生柱压升高、色谱峰拖尾、塔板数降低等问题。样品中含有微粒是导致筛板堵塞的主要原因。因此，为了避免此类问题的发生，必须在进样前将样品过0.45μm的滤膜。

2.1.2强保留样品组分

强吸附性的样品组分吸附在柱头填料上，能严重地缩短色谱柱寿命。分析生物组织或体液(如血浆)的提取物、含油剂等复杂样品时，这种滞留组分的影响尤其严重。色谱柱应用中，色谱峰严重拖尾或分叉的出现往往是强保留污染物在柱头吸附的体现。在进样阀与色谱柱之间加/支保护性的小预柱，能够有效减少强吸附组分对色谱柱的污染。小预柱通常为填充良好的1～2cm的短柱，内装有与色谱柱相当的填料。需要注意的是小预柱必须定期更换。

2.2 色谱柱的清洗与再生

2.2.1反相色谱柱的清洗与再生

常规样品污染的硅胶基质色谱柱，一般选用溶剂强度逐渐增大(极性逐渐减弱)的溶剂清冲洗，强疏水性的溶剂清洗非极性物质，如脂类。最常用的方法是用20倍柱体积(柱体积指色谱柱内空腔体积，4.6x250mm色谱柱的柱体积为4.2mL)的乙腈 (或甲醇)∶水=90∶10(V/V) →乙腈→二氯甲烷→乙腈→乙腈(或甲醇)∶水=90∶10(V/V)冲洗色谱柱。需要注意的是在清洗和再生的过程中，需要保证每种清洗溶剂和下一种清洗溶剂互溶。当金属离子污染色谱柱后，必须使用特殊的溶剂(磷酸和0.1mol/L柠檬酸)清洗色谱柱，才能得到再生。

2.2.2正相色谱柱的清洗与再生

正相色谱柱的清洗与再生的方法与反相色谱柱相反，用极性逐渐增强的溶剂冲洗。常用的方法正己烷→异丙醇→二氯甲烷→甲醇→二氯甲烷→异丙醇→正己烷冲洗，每种溶剂不少于20倍柱体积。

3 结语

在HPLC的使用过程中，务必做到一丝不苟，对仪器运行时的各种数据及时记录，这是对维护仪器的最重要的资源。在诊断仪器故障时，可应用单因素交替法，配合零部件替代法，迅速查出故障所在，并进行维护。总之，要想使HPLC处于高效运行状态，务必做好试样的前期处理，同时务必做好仪器的正确使用和维护。