萝卜硫素通过下调Traf6/TAK1信号传导抑制UVB诱导黑素生成的机制研究

刘彩玉 杨丽亚

[摘要]目的：研究萝卜硫素对中波紫外线（UVB）照射后黑素细胞产生黑素能力的抑制效应及其对Traf6/TAK1信号传导的影响。方法：采用人表皮黑素PIG1细胞为研究模型，分为对照组（Control）、模型组（Model，UVB照射）、萝卜硫素处理组（10、20、40μM）。CCK8法分析PIG1细胞增殖情况，氢氧化钠裂解法分析黑素含量，酶联免疫吸附试验（ELISA）分析优黑素含量，Western blot技术检测小眼畸形相关转录因子（MITF）、酪氨酸酶（TYR）、酪氨酸酶相关蛋白-1（TRP-1）、TRP-2、肿瘤坏死因子相关受体因子6（Traf6）及转录生长因子β-活化激酶1（TAK1）表达。结果：与对照组比较，UVB照射能诱导PIG1细胞黑素及优黑素含量显著升高（P<0.05），还能促使MITF、TYR、TRP-1、TRP-2、Traf6及p-TAK1蛋白表达水平显著增高（P<0.05）;与模型组比较，不同浓度萝卜硫素能降低PIG1细胞黑素及优黑素的生成（P<0.05），还能显著抑制MITF、TYR、TRP-1、TRP-2、Traf6及p-TAK1蛋白表达（P<0.05），呈现出剂量依赖性。结论：萝卜硫素通过抑制Traf6/TAK1信号传导降低UVB诱导PIG1细胞黑素生成。

[关键词]萝卜硫素;人表皮黑素细胞;黑素;信号通路;肿瘤坏死因子相关受体因子6;转录生长因子β-活化激酶1

[中图分类号]R329.2    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2019）03-0096-04

Abstract： Objective  To study the suppressed effects of sulforaphane on ultraviolet radiation B（ UVB）-stimulated melanogenesis of melanocytes（PIG1）， and observe its effect on Traf6/TAK1 signal pathway. Methods  PIG1 cells were cultured in vitro and divided into control group， UVB group（Model group）， sulforaphane intervention groups（10，20 and 40μM）. The cell proliferation was determined by CKK8 assay. Melanin and eumelanin were detected by NaOH splitting and ELISA assay， respectively. The expression levels of microphthalmia-associated transcription factor（MITF）， tyrosinase（TYR）， tyrosinase-related protein-1（TRP-1）， TRP-2， tumor necrosis factor associated receptor factor 6（Traf6）， transforming growth factor-β activated kinase-1（TAK1） were measured by Western blot. Results  Compared with control group， the contents of melanin and eumelanin were significantly increased（P<0.05）; the expression levels of MITF， TYR， TRP-1， TRP-2， Traf6 and p-TAK1 in PIG1 cells were also significantly increased（P<0.05）. Compared with model group， the expression levels of MITF， TYR， TRP-1， TRP-2， Traf6 and p-TAK1 were significantly suppressed， and production of melanin and eumelanin reduced in a dose dependent manner in each sulforaphane intervention group（P<0.05）. Conclusion  Sulforaphane inhibits melanin and eumelanin production through down-regulating Traf6/TAK1 signal pathway in UVB-irradiated melanocytes.

Key words： sulforaphane; melanocytes; melanin; pathway; Traf6; TAK1

蘿卜硫素（Sulforaphane）又称“莱菔子素”，属于异硫代氰酸盐衍生物，广泛分布于西兰花、花椰菜、甘蓝、萝卜及芥菜等十字花科植物。对萝卜硫素药理学研究发现，其具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎症及参与免疫调节等功效[1-4]。同时研究也发现萝卜硫素具有防治皮肤癌的作用，还有很强的光防护作用，主要包括预防皮肤炎症、红斑、皮肤上皮细胞氧化应激损伤，光老化及皮肤肿瘤等[5]。人的皮肤长期在紫外线下照射会引起色素沉积，适量的皮肤色素沉着对机体健康非常关键[6]，能够防止皮肤细胞遭受紫外线辐射引起的损伤[7]。然而过多的色素沉积会引起色斑、雀斑等症状[8]。其中黑素的产生需要酪氨酸酶参与，紫外线照射会诱导酪氨酸酶表达增高[9]，进而诱导黑素生成，因此降低酪氨酸酶的表达能够抑制黑素的产生。然而，萝卜硫素对皮肤黑素细胞产生黑素能力的影响报道甚少。因此，本文研究萝卜硫素对人表皮黑素PIG1细胞产生黑素及优黑素的影响，并探讨萝卜硫素对Traf6/TAK1信号通路的影响。

1  材料和方法

1.1 主要材料：原代正常人皮肤黑素细胞PIG1（来源于上海ATCC细胞库）;DMEM培养液、胎牛血清、胰蛋白酶（Gibco公司）;CCK8试剂盒（Solarbio公司）;RIPA裂解液（杭州四季青公司）;BCA蛋白定量试剂盒（北京康为世纪）;兔抗鼠MITF、TYR、TRP-1、TRP-2、Traf6、TAK1、p-TAK1及β-actin抗体（Abcam公司）;羊抗兔IgG二抗（上海谷歌生物公司）;ELC化学发光检测试剂盒（Advansta）;优黑素试剂盒（上海江莱生物科技有限公司）。

1.2 主要仪器：BIORAD-550型酶标仪（美国伯乐公司）;BBS-V800型单人超净台（山东鑫贝西公司）;SPX-250型细胞培养箱（美国Thermo公司）;GE-100型凝胶电泳仪（北京六一仪器厂）;Amersham Imager 600仪器（BIO-RAD，美国）。

1.3 PIG1细胞培养：采用含5%胎牛血清的DMEM培养基（不含抗生素）对PIG1细胞进行培养，培养箱条件设置为5% CO2、37℃恒温。

1.4 UVB照射及萝卜硫素处理：把对数生长期的PIG1细胞接种至6孔板，每孔3×105个细胞，分为对照组（Control）、模型组（Model，UVB照射）、萝卜硫素处理组（10、20、40μM）。待细胞生长24h后，模型组和萝卜硫素处理组细胞接受285～320nm波长的UVB照射（30mJ/cm2），照射结束后更换含不同浓度萝卜硫素的新鲜培养液。连续UVB照射3d，末次照射后24h进行检测。

1.5 CCK8实验：对数生长期的PIG1细胞接种至96孔板，每孔1×105个细胞，培养过夜后，加入不同浓度萝卜硫素（0、1、5、10、20、40、60、80、100μM）处理细胞24h。除去旧培养液，每孔加入20μl CCK8试剂，放于恒温培养箱中继续培养2h，置于450nm波长的酶标仪中检测细胞吸光度A值，并计算细胞相对存活率（%）=A实验组/A对照组×100%。

1.6 黑素检测：对数生长期的PIG1细胞接种至6孔板，每孔3×105个细胞，培养24h后，按照“1.4”中的方法处理细胞，UVB照射及萝卜硫素干预完成后，收集细胞，加入200μl含10% DMSO的NaOH（1mol/L）溶液，水浴（90℃，1h），置于405nm波长的酶标仪中检测各孔细胞吸光度A值。

1.7 优黑素检测：对数生长期的PIG1细胞接种至6孔板，每孔3×105个细胞，培养24h后，按照“1.4”中的方法处理细胞，UVB照射及萝卜硫素干预完成后，收集细胞加入裂解液，BCA试剂盒测定蛋白浓度，调节每个样品蛋白浓度一致后，采用ELISA试剂盒检测优黑素含量。

1.8 Western blot实验：收集“1.7”中细胞裂解液，BCA法测定总蛋白浓度后，每孔上样50μg进行凝胶电泳（恒压70V，3h），待蛋白完全分离后进行蛋白转膜实验（恒流275mA，70min），5%脱脂牛奶封闭蛋白条带1h后，孵育一抗（MITF、TYR、TRP-1、TRP-2、Traf6、TAK1、p-TAK1及β-actin，稀释比1‥1 000）4℃过夜，TBST洗膜3次，室温孵育二抗（稀释比1‥3 000）90min，TBST洗膜3次，ECL显色，黑室曝光。蛋白条带灰度值采用Image J软件进行分析。

1.9 统计分析：采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，组间差异采用单因素方差分析，P<0.05为差异有显著性。

2  结果

2.1 萝卜硫素对PIG1细胞增殖的影响：0μM处理组用含1.2‰ DMSO培养液干预细胞，结果提示与对照组相比未发生明显变化，说明培养液中1.2‰含量的DMSO对PIG1细胞增殖没有影响。萝卜硫素浓度小于60μM时，细胞相对存活率没有发生显著变化，但浓度高于60μM时，随着萝卜硫素剂量的升高细胞存活率显著降低，当萝卜硫素剂量为60、80、100μM时细胞存活率分别降低（12.3±3.1）%、（18.6±3.9）%、（25.1±4.3）%。因此，后续实验选择低（10μM）、中（20μM）、高（40μM）3种剂量萝卜硫素。不同剂量萝卜硫素对PIG1细胞相对存活率影响见图1。

2.2 萝卜硫素对PIG1细胞黑素生成的影响：与对照组（Control）相比，模型组（Model）中PIG1细胞黑素生成量显著增高（P<0.05）;低、中、高濃度萝卜硫素组中黑素含量相对于模型组分别降低（10.6±3.7）%、（20.0±3.8）%、（29.6±5.1）%，差异均有统计学意义（P<0.05）。萝卜硫素对PIG1细胞黑素生成的抑制作用见图2。

2.3 萝卜硫素对PIG1细胞优黑素生成的影响：与对照组（Control）相比，模型组（Model）中PIG1细胞优黑素生成量显著增高（P<0.05）;低、中、高浓度萝卜硫素组中优黑素含量相对于模型组分别降低（22.2±4.2）%、（37.0±4.9）%、（48.1±5.6）%，差异均有统计学意义（P<0.05）。萝卜硫素对PIG1细胞优黑素产生的抑制作用见图3。

2.4 萝卜硫素对PIG1细胞中TYR、TRP-1、TRP-2及MITF蛋白表达的影响：模型组细胞中TYR、TRP-1、TRP-2及MITF蛋白表达相对于对照组明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组比较，低、中、高剂量萝卜硫素组细胞中TYR、TRP-1、TRP-2及MITF蛋白表达均显著降低，差异比较有显著性（P<0.05）。研究还发现TYR、TRP-1、TRP-2及MITF蛋白表达随萝卜硫素浓度增高而降低，表现出剂量依赖性，各药物组比较差异有显著性（F=13.068，P<0.05）。各组间TYR、TRP1、TRP2及MITF蛋白表达水平见图4，表1。

2.5 萝卜硫素对PIG1细胞中Traf6/TAK1信号通路的影响：模型组细胞中Traf6、p-TAK1蛋白表达相对于对照组明显增高，差异比较有统计学意义（P<0.05）。与模型组比较，低、中、高剂量萝卜硫素组细胞中Traf6、p-TAK1蛋白表达均显著降低，差异有显著性（P<0.05）。研究还发现Traf6、p-TAK1蛋白表达随萝卜硫素浓度增高而降低，表现出剂量依赖性，各药物组比较差异有显著性（F=12.507，P<0.05）;而TAK1蛋白在各组细胞中表达无明显变化。各组间Traf6、TAK1、p-TAK1蛋白表达水平见图5，表2。

3  讨论

人皮肤组织含有两种类型黑素，即优黑素及褐黑素[10]。优黑素发挥的生物学作用相对褐黑素稍强，前者可以防止UVB照射降解黑素细胞。黑素沉积时优黑素水平增高，褐黑素水平降低，而且优黑素还能向褐黑素转化[11]，进而降低黑素含量。研究报道MITF、TYR、TRP-1、TRP-2蛋白均与黑素产生有直接关系[12]，酪氨酸酶相关的酶不仅诱导黑素产生导致皮肤色素沉积，而且介导了哺乳动物皮肤色素沉积紊乱[13]。因此，抑制黑素产生相关蛋白的活性是阻止色素沉积的重要途径。黑素沉积的发病机制复杂，具有顽固性和复发性的特点，研究发现紫外线日晒在其发病机制中起着重要作用[14]。

本实验考察了萝卜硫素处理紫外线照射的PIG1细胞后，分析了细胞中黑素含量及MITF、TYR、TRP-1、TRP-2蛋白表达水平的变化。结果提示，UVB照射后PIG1细胞黑素水平明显增高;而萝卜硫素能呈浓度依赖性抑制UVB照射诱导的黑素产生。Western blot结果说明UVB照射可诱导PIG1细胞中MITF、TYR、TRP-1、TRP-2蛋白表达量的增高，而萝卜硫素处理后可以呈浓度依赖性地抑制相关蛋白的表达。提示萝卜硫素可通过抑制酪氨酸酶相关蛋白表达进而降低PIG1细胞中黑素的产生。

肿瘤坏死因子相关受体因子6（Traf6）广泛分布于多种组织中，可介导细胞内多种生物学信号传导[15]。相关研究发现黑素细胞在非活跃状态下能够低表达Traf6，而在黑素瘤细胞中呈高表达状态[16]，并且在UVB照射等刺激下能够诱导Traf6表达上调[17-18]。亦有研究提示，萝卜硫素能通过抑制Traf6信号传导降低猪肺泡巨噬细胞炎症反应[19]。早期研究已提出Traf6信号活化能够诱导转录生长因子β-活化激酶1（TAK1）磷酸化，进而发挥多种生物学作用，包括调节增殖、黏附、分化，和生存等细胞过程[20]。已有研究表明TAK1磷酸化后能与MITF发生相互作用，诱导MITF表达[21]。但是，本文缺乏相关研究来证实萝卜硫素诱导MITF表达下调是由于Traf6/TAK1信号传导的抑制，无法得出Traf6/TAK1信号通路与MITF的上下游关系。因此，后期将会采用Traf6/TAK1信号通路抑制剂或激动剂干预黑素细胞，来探讨萝卜硫素是否通过调控Traf6/TAK1信号通路介导MITF表达，进而改变黑素的产生。

上述研究结果显示，调节Traf6/TAK1信号通路很可能是萝卜硫素影响黑素细胞黑素产生的重要机制。实验结果也发现，UVB照射可诱导PIG1细胞中Traf6和p-TAK1蛋白的表达，而萝卜硫素处理后可以呈浓度依赖性地抑制Traf6和p-TAK1蛋白的表达。提示萝卜硫素可通过抑制Traf6/TAK1信号通路活化进而降低PIG1细胞中黑素的产生。

总之，萝卜硫素抑制UVB照射诱导的黑素生成的藥理作用，可能与其通过抑制Traf6/TAK1信号传导，进而降低MITF、TYR、TRP-1、TRP-2蛋白表达有关。该实验结果有助于加深对药物治疗机制的理解，为皮肤黑素沉积疾病的临床治疗提供理论参考。然而黑素产生是一个复杂的过程，在萝卜硫素降低黑素产生的过程中，是否还有其他信号通路的参与还需进一步研究。

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[收稿日期]2018-12-13

本文引用格式：劉彩玉，杨丽亚.萝卜硫素通过下调Traf6/TAK1信号传导抑制UVB诱导黑素生成的机制研究[J].中国美容医学，2019，28（3）：96-99.