60Coγ射线全身照射后大鼠血浆中*GDF-15、Flt-3L和SAA表达的剂量相关性研究

孙佳丽 李 爽 田 梅 刘青杰*

辐射损伤的早期生物标志物对核事故或者核恐怖袭击中受照人群进行分类和治疗至关重要。研究表明，有些蛋白质可以作为候选的辐射生物标志物，辅助估算辐射暴露剂量[1-2]。Fms样酪氨酸激酶3配体(Fms-like tyrosine kinase 3 ligand，Flt-3L)和血清淀粉样蛋白A(serum amyloid a protein，SAA)在辐照后的小鼠和非人灵长类的血浆中表达增高，有研究将其作为辐射敏感候选生物标志物[3-4]。然而，Flt-3L和SAA在辐照后大鼠血浆中的表达情况尚不清楚。Flt-3L蛋白是一种内源性小分子，可以通过激活造血祖细胞增加免疫细胞(B细胞和T细胞)的数量；还可以动员体内造血祖细胞和干细胞，这可能有助于机体杀死癌细胞[5]。SAA是在炎症的急性期分泌，具有多种功能，包括将免疫细胞募集到炎症部位，以及诱导酶降解细胞外基质等[6]。

生长分化因子-15(growth differentiation factor-15，GDF-15)属于转化生长因子β超家族的一种蛋白质，在心血管疾病中观察到GDF-15蛋白有调节细胞凋亡、细胞修复和细胞生长的作用[7]。在前期研究中，利用基因芯片技术筛选辐射差异表达基因，其中GDF-15基因是所有基因中受电离辐射诱导后表达变化最为显著的基因[8]。通过γ射线和锎252(252Cf)中子源照射人永生化淋巴细胞株，发现其蛋白质表达水平也呈现出良好的剂量效应关系[9]。但是，细胞株辐照后的变化不能反应全身照射后的电离辐射引起的改变，有必要研究全身照射后血浆GDF-15蛋白的表达情况。因此，本研究通过分析大鼠全身照射后Flt-3L、SAA和GDF-15蛋白在血浆中的表达情况，为进一步探究作为大鼠全身照射的辐射敏感蛋白可能性提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

选取无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级(Sprague Dawley， SD)大鼠72只，雄性，8周，体重(230±10)g，购自北京大学医学部实验动物科学部，生产许可证号：SYXK(京)2016-0010)，在北京大学医学部实验动物科学部饲养，屏障环境使用许可证：SYXK(京)2016-0041)。饲养条件的温度为(22±2)℃，相对湿度为40%～60%，噪声dB声湿度。实验前将大鼠按标准采食量饲喂并自由饮水1周，观察大鼠的生长状态，将生长健康的大鼠纳入研究。将72只健康SD大鼠按照照射剂量分为0 Gy组、1 Gy组、3 Gy组和5 Gy组，每组18只，每6只饲养在同一笼里。本研究的实验方案经过中国疾病预防控制中心辐射安全所实验动物伦理福利委员会审查批准。

1.2 材料与仪器

(1)材料。Flt-3L酶链免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒和SAA ELISA检测试剂盒，购于武汉华美生物工程有限公司；GDF-15 ELISA检测试剂盒，购于美国R&D公司。

(2)仪器。MR23i低温冷冻离心机(美国Thermo Scientific)；Thermo Labsystems MK3酶标仪(美国Thermo Scientific)。

1.3 照射方法

采用60Co γ射线照射大鼠，60Co γ射线辐照源由北京市辐照中心提供，源强130 TBq，源靶距84 cm，照射视野面积30 cm×30 cm，单次全身照射，剂量率为1 Gy/min，每组剂量分别为0 Gy、1 Gy、3 Gy和5 Gy。

1.4 样品采集及处理

经60Co γ射线照射1 d、3 d和5 d后，通过大鼠眼眶内眦静脉采血，采集的血液存放在EDTA抗凝负压管中，30 min内离心，4 ℃，3000 r/min，离心10 min，取上清，分离的血浆分装后冻存于-80 ℃冰箱备用。

1.5 血浆蛋白ELISA检测方法

将各种试剂移至室温平衡30 min备用；分别向标准孔、待测样品孔中加样100 μl，轻轻晃动后于37 ℃温育2 h；弃去液体甩干，不洗涤；每孔加入生物素标记抗体工作液100 μl，于37 ℃温育1 h；弃去液体甩干，洗板3次，每次每孔200μl洗涤液，每次2 min，甩干；每孔加入辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100 μl，于37 ℃温育1 h；弃去液体甩干，洗板5次，每次每孔200μl洗涤液，每次2 min，甩干；每孔加入底物溶液90μl，于37 ℃避光显色15～30 min后，每孔加入终止溶液50μl，终止反应。终止后5 min内用酶标仪450 nm波长测量各孔的光密度(OD值)。

1.6 数据分析

ELISA数据采用标准品及样品值减去S0孔数值(S0孔是标准孔中只加稀释液，未加标准蛋白的校正孔)，复孔取其平均值后，绘制曲线。以标准品的浓度为纵坐标，OD值为横坐标，利用专业制作曲线的软件“Curve Expert”进行绘图并计算出样本浓度。

1.7 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。数据以均值±标准差(±s)表示。多个样本均数间比较经过正态性和方差齐性检验，采用单因素方差分析(oneway， ANOVA)；若方差分析组间效应有统计学意义时，表示至少有两组的总体均数不同，采用LSD-t检验(least significance difference test)进一步分析组与组之间的差别。采用线性回归方法建立剂量-效应方程，ANOVA分析剂量-反应曲线方程的意义，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物的一般状态

照射后大鼠进食与饮水情况良好，无死亡，未观察到明显的脱毛呕吐现象。照射后1 d和3 d，1 Gy组、3 Gy组和5 Gy组的大鼠体重与0 Gy组相比，体重明显降低且差异有统计学意义(t=6.20，t=2.34，t=8.05，t=5.09，t=5.34，t=9.59；P＜0.05)，见表1；照射后5 d，3 Gy组和5 Gy组与0 Gy组比较，大鼠体重降低且差异有统计学意义(t=2.74，t=10.06；P＜0.05)。5 Gy剂量组大鼠的体重，随着照射后时间的延长，体重并未升高，1 Gy组和3 Gy组大鼠的体重，随着饲养时间的延长体重有不同程度的增长。

表1 SD大鼠不同时间全身照射前后体重的变化(±s)

表1 SD大鼠不同时间全身照射前后体重的变化(±s)

不同时间照射后体重(g)1 d t值 P值 3 d t值 P值 5 d t值 P值0 Gy组 6 230.2±8.84 281.2±5.08 - - 301.0±2.61 - - 305.3±11.54 - - 1 Gy组 6 230.2±10.26 242.6±9.33 6.20 ＜0.05 258.8±12.52 5.09 ＜0.05 296.0±4.00 0.17 ＞0.05 3 Gy组 6 229.7±9.16 240.4±8.69 2.34 ＜0.05 259.2±10.40 5.34 ＜0.05 276.6±14.28 2.74 ＜0.05 5 Gy组 6 231.3±8.86 228.0±11.34 8.05 ＜0.05 226.0±14.79 9.59 ＜0.05 221.0±7.09 10.06 ＜0.05组别 样本数(只)照射前1周体重(g)

2.2 GDF-15蛋白表达变化

在每个观察时间点，血浆中GDF-15蛋白的表达量随着照射剂量的增加而明显升高。各剂量组与0 Gy组比较，其GDF-15蛋白均在照后1 d达到最高值，1 Gy组血浆GDF-15蛋白浓度为(313.71±19.08)pg/ml，3 Gy组为(672.75±133.33)pg/ml，5 Gy组为(1402.54±526.08)pg/ml。照后1 d，1 Gy组血浆中GDF-15蛋白表达升高4倍，3 Gy组升高9倍，5 Gy组升高18倍；照后3 d和5 d，3 Gy组和5 Gy组的GDF-15蛋白表达量与0 Gy组相比，表达增高且差异有统计学意义(t=3.09，t=6.32，t=8.91，t=10.71，t=2.73，t=6.64，P＜0.05)。各剂量组中，同一剂量点GDF-15蛋白的表达量均在照射后1d达到最高值，随着照射后时间的延长表达量降低，如图1所示。

图1 60Co γ射线全身照射后SD大鼠不同时间点血浆中GDF-15蛋白的表达变化示图

照射后1 d、3 d和5 d，大鼠血浆中的GDF-15蛋白表达量与照射剂量之间呈现出良好的剂量-效应关系，拟合直线方程的R2≥0.887，见表2。

表2 60Co γ射线全身照射后SD大鼠血浆GDF-15蛋白表达水平的剂量-效应关系

2.3 Flt-3L蛋白表达变化

大鼠血浆Flt-3L的表达量在照射后1 d、3 d和5 d，有随剂量升高而升高的趋势，照射后5 d的剂量-效应趋势最好。在照射后1 d、3 d和5 d，与0 Gy组比较，5 Gy组血浆中Flt-3L的表达量均明显升高，差异有统计学意义(t=4.22，t=8.48，t=5.51；P＜0.05)；3 Gy组只在照后1 d和5 d表达增高，差异有统计学意义(t=5.79，t=3.69；P＜0.05)。在照射后3 d，1 Gy组和5 Gy组照射的大鼠血浆Flt-3L的表达量达到最高值，1 Gy组达到(161.34±28.47)pg/ml，5 Gy组为(239.04±51.49)pg/ml。3 Gy组照射后Flt-3L的表达量在照后1 d达到最高值，浓度为(198.96±26.22)pg/ml。各剂量组在照射后随着饲养时间的延长，血浆中Flt-3L的表达呈波动变化，如图2所示。

图2 60Co γ射线全身照射后SD大鼠不同时间点血浆中Flt-3L蛋白的表达变化示图

照射后3 d和5 d，大鼠血浆中的Flt-3L蛋白表达量与照射剂量之间呈现出了良好的剂量-效应关系，拟合直线方程的R2≥0.861，见表3。

表3 60Co γ射线全身照射后SD大鼠血浆Flt-3L表达水平的剂量-效应关系

2.4 SAA蛋白表达变化

在照射后1 d、3 d和5 d，大鼠血浆中SAA的表达量随着照射剂量升高变化趋势不同，只有照射后1 d，有随着照射剂量升高SAA表达量增加的趋势。照射后1 d和3 d，5 Gy组SAA的表达量与0 Gy组比较表达升高，差异有统计学意义(t=2.53，t=2.28；P＜0.05)；照射后5 d各剂量组与0 Gy组比较，SAA的表达量的差异均无统计学意义(F=2.71，P＞0.05)，如图3所示。

图3 60Co γ射线全身照射后SD大鼠不同时间点血浆中SAA蛋白的表达变化示图

3 讨论

有研究表明，小鼠在照射后会出现体重等身体机能指标的变化。本研究发现照射后SD大鼠出现了体重下降或者体重增长变缓的情况。Ossetrova等[3]研究发现，小鼠在照射1～3 Gy和6～8 Gy时，均是在照射后3 d体重下降最明显。本研究中大鼠在照后1 d与0 Gy组相比，其他3组体重有明显的下降，可能是暴露于照射因素以及运输中的不良环境等综合因素导致；照后3 d、5 d，1 Gy组和3 Gy组大鼠体重都有增长，5 Gy组大鼠体重未见增长，表明照射对大鼠的生长造成了一定影响。

GDF-15基因是TGF-1家族的一个成员，可以被IL-1、IL-2和TNF-9等细胞因子激活，最早在巨噬细胞中被发现[4]。是DNA损伤信号传导的重要下游介导物[10]。多种化学应激和环境因子诱导GDF-15表达升高，提示GDF-15在细胞稳态中起着关键作用[11]。Sándor等[12]研究发现，GDF-15蛋白在辐照后人成纤维细胞中表达升高，可能成为辐射诱导细胞的早期生物标志物。本实验室研究也证实GDF-15蛋白在照射后人永生化淋巴细胞株中表达增高，并具有良好的剂量-效应关系[9]。本研究中GDF-15蛋白在大鼠照后1 d血浆中的量效关系最好，这与其在照射后的人永生化淋巴细胞株中的表达情况相同，不同点在于两个研究中GDF-15蛋白表达量上的差别，如照后1 d的人永生化淋巴细胞株中GDF-15蛋白在5 Gy组的表达量是0 Gy组的2倍，在相同条件下，全身照射5 Gy组的大鼠血浆中GDF-15蛋白表达量是0 Gy组的18倍。

Flt-3L是调节造血系统最重要的细胞因子之一，其作用是刺激各种造血祖细胞的增殖和分化。由于在小鼠和非人灵长类的研究中表现出对骨髓照射的高度特异性，Flt-3L被作为辐射诱导的骨髓再生障碍严重程度的生物标志物[13-14]。本研究发现，大鼠血浆中Flt-3L的表达情况和一些研究中小鼠中的表达趋势相似；Kim等[15]采用X射线照射小鼠、Sproull等[16]和Ostrava等[17]采用γ射线照射小鼠，全身照射剂量在1～6 Gy，照射后1～5 d，小鼠血浆中Flt-3L的表达都随着受照射剂量的增加表达量升高，而且研究发现小鼠血浆中Flt-3L在照射后2 d和3 d的量效趋势很好；在非人灵长类的研究中发现，Flt-3L在照射后2 d和7 d的量效趋势最好[18]。本研究中Flt-3L的表达在照射后各时间点有随照射剂量增加而升高的趋势，用Flt-3L拟合剂量-效应曲线，照射后1 d，剂量-效应关系不太理想，照射后3 d和5 d拟合的曲线比较好。

SAA通过刺激细胞因子在肝脏中合成，在炎症反应中起着重要作用；SAA可在辐射刺激后数日检测到，其是否发生显著性变化取决于头部是否在辐射场中；SAA动态变化水平可以作为反应时间进程和急性放射病严重程度的候选指标，并可作为非均匀辐射暴露谱中辐射暴露的生物标志物[19-21]。SAA是急性反应蛋白，辐射等刺激因素出现后，SAA表达会升高。有研究发现，照射后小鼠血浆中SAA在4 h后表达量开始增多，照射后1 d表达量达到顶峰，其中5 Gy组的表达量是基线水平的10倍左右[3，20，22]。然而，本研究中大鼠全身照射5 Gy组的表达量仅为基线水平的1.82倍，推测可能是大鼠血浆中SAA蛋白对辐射敏感度较低。Blakely等[23]在研究X射线照射后的CD2F1小鼠时发现，血浆中SAA的表达量并不表现依赖照射剂量增加而升高。由此可以看出SAA作为辐射敏感蛋白在不同的实验中表达可能并不稳定。由于本研究的数据有限，关于SAA在大鼠血浆中的表达情况还有待进一步研究。

Flt-3L蛋白在大鼠全身照射后5 d呈现出最好的剂量-效应关系， GDF-15蛋白在大鼠全身照射后1 d呈现出最好的剂量-效应关系。但是，由于本研究样本数量有限，血浆中Flt-3L和GDF-15蛋白能否作为大鼠全身照射后候选的辐射敏感生物标志物还有待深入探索。