茂兰喀斯特森林小生境类型对土壤微生物群落组成的影响

吴求生,龙 健,*,李 娟,廖洪凯,刘灵飞,吴劲楠,肖 雄

1 贵州师范大学贵州省山地环境信息系统与生态环境保护重点实验室,贵阳 550001 2 贵州师范大学地理与环境科学学院,贵阳 550001

微生物是地球最早出现的生命形式,其出现决定了地球演化的方向和进程,推动了土壤的发生和发育[1],不少学者从不同角度、利用不同技术手段对农田及森林土土壤微生物进行了大量研究[2-4],得出一系列成果；土壤微生物参与土壤有机质的分解与积累以及氮、磷等元素的转化过程[1,5],这一系列过程受到多种因素综合影响。研究土壤微生物分布特征与土壤理化性质关系及其对土壤环境变化的响应机制,对进一步明确其生态过程具有重要意义。

喀斯特环境是我国西南山区一个独特的生态环境系统,与黄土、沙漠、寒漠并列为我国四大生态环境脆弱区[6-7]。喀斯特山区地表破碎、土壤浅薄、分层复杂,且大多数土壤留存于地表发育的石缝、石洞、石沟等小生境中,使得喀斯特地区原本有限的土壤资源显得弥足珍贵[8]。近年来,针对喀斯特地区小生境分布的特点,学者们主要围绕小生境土壤理化性质、类别、以及代表性取样方法等进行系统研究,结果表明喀斯特地区小生境土壤理化性质存在极强地空间异质性[9-13]。土壤微生物对环境变化敏感度高,小生境土壤空间异质性以及水热状况的差异,势必对土壤微生物群落结构产生较大影响。然而,目前针对喀斯特地区不同小生境类型是如何影响土壤微生物群落结构及其稳定性的研究,鲜有报道。

茂兰喀斯特原始森林位于贵州省荔波县境内,是目前世界上同纬度地区喀斯特原生性森林分布面积最大的地区,该地区分布着复杂的生境类型,对整个西南喀斯特地区具有较好的代表性。本研究以茂兰保护区原始森林小生境为研究对象,探讨不同小生境类型对土壤微生物群落组成特征的影响,结合多元回归树(Multivariate Regression Tree,MRT)分析方法对小生境类型进行聚类,分析不同小生境间的区别和联系。旨在了解喀斯特地区小生境土壤微生物分布特征及其对土壤环境变化响应机制,为喀斯特山区微生物多样性保护及石漠化防治提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 研究区域概况

贵州荔波茂兰国家级喀斯特自然保护区地处107°52′—108°05′E,25°09′—25°20′N。年均温度18.3℃,≥10℃积温5767.9℃,全年降水量1320.5 mm,集中分布于4—10月；年均相对湿度8%；年均霜日7.3 d；全年日照时数1272.8 h；属中亚热带季风湿润气候,实验区喀斯特森林主要为常绿和落叶种群混生格局,主要树种有：中华蚊母树(Distyliumchinense)、青冈栎(Cyclobalanopsisglauca)、圆果化香(Platycaryalongipes)、多脉榆(Ulmuscastaneifolia)、黄连木(Pistaciachinensis)、掌叶木(Handeliodendronbodinieri)、翅荚香槐(Cladrastisplatycarpa)、香叶树(Linderacommunis)等,乔灌层郁闭度达0.95,群落高度约8—12 m；区内主要出露岩石为纯质石灰岩和白云岩,与常态地貌相比,生境复杂多样,有石面、石沟、石洞、石槽、石缝、土面等小生境[13-14]。另外,区内土壤以黑色石灰土为主,土层浅薄不连续,富含有机质及其他营养物质(氮、磷、钾、钙等)[15]。

1.2 采样方法与指标测定

于2017年春季进行野外考察并采集土壤样品。因采样区地形为坡度走向形势,为缩小因微地貌等自然条件带来的采样误差,样地的选择以小生境集中程度为前提。为探索喀斯特山区土壤理化性质及微生物在垂直水平上的特点,特对土面进行分层采集样品,根据为土壤颜色分层,把土面厚度约为0—10 cm的土层约定为土面表层,厚度为约10—20 cm的土层约定为土面下层,石沟、石槽、石洞等生境的土壤浅薄,无明显分层现象,因此未对此类生境土壤分层采集。共选取3个样方(20 m×20 m),每个样方6类小生境：石沟、石洞、石槽、石缝、土面表层(top-soil,约为0—10 cm)、土面下层(sub-soil,约10—20 cm),每个类型采3—5个土样,共采集69个小生境土样。每个样方同类型生境土壤均匀混合,最后共计18个样品。用无菌袋封装20 g左右,用于测定磷脂脂肪酸(带回实验室后,充分混匀无菌袋中土样,过2 mm筛,混匀,以四分法取样,一周内测),其余样品带回实验室后,分成两部分,一部分土样自然风干,用于测土壤总碳、总氮及pH等指标；一部分保存在4℃冰箱备用。

土壤总碳、总氮采用元素分析仪Vario micro cube(Elementar)测定：风干土样,过0.149 mm尼龙筛,取适量样品置于铝盒中,烘箱60℃经8 h去除水分,冷却,称量140—160 mg,其中,石槽和石沟土壤碳含量过高,因此称取40—50 mg,上机测定；有机质测定采用浓硫酸-重铬酸钾外加热法[16]；pH测试采用玻璃电极法。

微生物测定采用磷脂脂肪酸生物标记法[17]：称取适量冷冻干燥土于离心管中,按顺序加入柠檬酸缓冲液、氯仿、甲醇；涡旋振荡,遮光振荡2 h,离心,转移；加入柠檬酸缓冲液、氯仿,振荡,间隔放气,遮光隔夜静置,4℃保存；吸除上层缓冲液(废液),下层氯仿相转移,氮气吹干；萃取(SPE),转移并加入甲醇,氮吹；加甲醇甲苯混合液,溶解磷脂,加氢氧化钾溶液,水浴；加正己烷氯仿混合液、醋酸、去离子水,振荡、离心,将上层有机相转移至小试管；加正己烷氯仿混合液,重复提取,振荡、离心,转移上层有机相至小试管,氮吹干；正己烷溶解磷脂脂肪酸甲酯,转移至GC内插管中,上机测(Agilent7890B)。

标记的脂肪酸与土壤微生物对应关系见表1。磷脂脂肪酸计算用峰面积和内标曲线法[18],内标为19:0,含量用nmol/g表示。

表1 微生物指示脂肪酸

i、a、cy、Me表示异、反异、环丙基和甲基分枝脂肪酸;ω、c分别表示脂肪端顺式空间构造

1.3 数据处理

主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)对物种变量降维,降维结果被投影在二维坐标上,可清楚地看出物种在样方中分布情况及组成特征,本研究利用PCA分析不同小生境类型对土壤微生物特征PLFA分布和组成特征的影响。

MRT以小生境土壤理化因子为分类节点,利用二歧式分割法,将微生物种类和含量定义的生境逐步划分为同质性高的组。每一次划分都是以某一土壤理化因子的某个值将小生境分成两个部分,使得节点左右两组组内小生境微生物差异尽量小,组间差异尽量大,然后对划分出来的小生境以同样方式继续分组,直至分割结果满足某种条件而终止[26]。MRT可利用交叉验证对分类结果进行“剪枝”,以得到数量合适的树,“1SE”准则[27-28]是常用于确定树的大小的方法。

实验数据运用Excel和SPSS 22.0软件进行处理,采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和最小显著差异法(LSD)检验各指标在不同类型生境中的差异情况,显著水平设为P= 0.05；PCA分析、MRT分析分别用R语言(https://www.r-project.org)程序包vegan[29]和MVPARTwrap[30]进行。用Origin2017软件和R语言作图。

2 结果与分析

2.1 不同小生境类型对土壤理化性质的影响

小生境土壤有机质变化范围在60—546 g/kg,石槽有机质含量显著高于其他小生境(P<0.05)(表2)；不同小生境类型土壤pH存在较大差异,总体上呈石缝>石洞>石槽>土面表层>石沟>土面下层的趋势；总碳在小生境中呈现规律与有机质一致；石槽总氮含量显著高于石沟,石沟显著高于其他生境；石槽碳氮比显著高于土面下层,与其他生境呈差异不显著。

表2 小生境土壤理化性质

表中数据为平均值±标准误差,同一列不同小写字母表示小生境间达显著差异水平(P<0.05)

2.2 不同小生境土壤微生物的PLFA分析

2.2.1 不同小生境对土壤PLFA种类和总量的影响

6种小生境中共检测到48种PLFA生物标记,其中,石沟土壤中有47种,总含量为(296.45±23.18) nmol/g；土面表层有40种,总含量为(234.21±22.60) nmol/g；石洞土壤有44种,总含量为(206.96±50.18) nmol/g；石缝土壤有43种,总含量为(155.74±83.93) nmol/g；石槽土壤有39种,总含量为(388.34±73.82) nmol/g；土面下层有35种,含量为(127.04±71.81) nmol/g；6种小生境土壤完全分布的PLFA有30种,如14:00、15:00、16:00、14:0 iso、15:0 iso、16:0 iso等,不完全分布的PLFA有18种,如24:00、14:0 iso、21:1 ω8c、21:1 ω3c、22:1 ω3c、23:1 ω4c等未见分布于土面下层,但在其余生境中均被检测出,17:1 ω8c仅出现在石槽中,19:1 ω7c 10-methyl仅出现在石沟中。土面下层PLFA含量显著低于土面表层、石沟以及石槽,与石洞、石缝PLFA含量差异不显著(图1)。

从总体上看,不同生境类型土壤PLFA基本以16:00(细菌)、15:0 iso(革兰氏阳性菌)、16:0 iso(革兰氏阳性菌)、18:1 ω7c(革兰氏阴性菌)、18:1 ω9c(真菌)、19:0 cyclo ω7c(未知)、16:0 10-methyl(放线菌)、18:0 10-methyl(放线菌)等PLFA类型为主,这8种PLFA相对含量占总PLFA相对含量的70%。

图1 不同小生境土壤PLFA种类和总量统计结果Fig.1 The type of PLFA and total contents in different microhabitats of soil土表指土面表层(top-soil),土下指土面下层(sub-soil)

2.2.2 不同小生境土壤微生物特征PLFA主成分分析

对不同小生境土壤微生物特征PLFA进行主成分分析,结果见图2。第一主轴和第二主轴分别解释土壤特征PLFA方差的52.29%和25.36%；石槽PLFA含量最高,其次是石沟,最后是土面下层,但石缝和土面下层的16:0 anteiso、18:1 ω5c、18:2 ω6c、16:0 iso、17:0 iso以及17:0 anteiso等特征PLFA相对含量高于石沟和石槽。石槽、石缝以及土面下层离坐标原点较远,石沟和土面表层离坐标原点较近。

图2 不同小生境土壤特征PLFA的主成分分析Fig.2 Principal components analysis of specially PLFA in soil of different microhabitats

2.2.3 不同小生境对土壤特征微生物类群PLFA含量的影响

石槽土壤微生物总量显著高于其他生境类型(P<0.05),并且其他生境间两两差异不显著；真菌含量在土面下层、石缝、石洞、土面表层等生境中表现为差异不显著,在土面下层、石沟、石槽中表现为差异显著；放线菌分布规律与真菌类似；细菌分布规律与微生物总量分布一致；土面下层的G+含量与石缝、石洞及土面表层的土壤G+含量表现为差异不显著,与石沟、石槽表现为差异显著；G-在不同生境类型中分布情况与微生物总量、细菌分布规律相同；土面下层的G+/G-值高于其他生境类型,与石槽、石沟、土面表层及石缝表现为差异显著；真菌/细菌变幅为0.14—0.16,具体表现为土面表层>石缝>石沟>石槽>石洞>土面下层,在6种生境类型中两两间呈差异不显著。总体上,土壤微生物总量、细菌、真菌、放线菌、G+、G-含量均表现为石槽>石沟>土面表层>石洞>石缝>土面下层。

图3 不同小生境土壤微生物群落结构组成特征Fig.3 Composition of soil microbial community structure in different microhabitats

2.3 不同小生境土壤微生物与理化因子的相关性

不同小生境土壤微生物及其比值与理化因子相关性分析结果见表3。

表3 小生境土壤微生物与理化因子的相关性

*表示P<0.05,**表示P<0.01

图4 MRT分析简要图Fig.4 A summary tree of the MRT analysis (1)：图中Ogm:有机质,Organic matter；(2)R2表示回归树对物种方差解释比例；(3)误差表示回归树不能解释的方差比例；(4)CV误差表示交叉验证误差；(5)图中带有()的数字表示节点；(6)：节点下方的百分比表示环境因子对该节点中微生物组成方差解释比例；(7)：树叶中n为小生境个数

土壤微生物总量、细菌、真菌、放线菌与有机质、总碳、总氮呈显著正相关(P<0.05),与碳氮比呈极显著正相关(P<0.01)；G+与有机质、总碳、总氮呈显著正相关(P<0.05),G-与有机质、总碳、总氮呈极显著正相关(P<0.01)；5种微生物及其总量均与pH呈负相关,但未达到显著水平(P>0.05)；G+/G-与pH呈正相关,与有机质、总碳、总氮以及碳氮比呈负相关,并且与碳氮比达到显著水平；真菌/细菌与pH、有机质、总碳、总氮以及碳氮比均呈正相关,但未达到显著水平。

2.4 基于MRT分析的小生境类别划分

对回归树进行“剪枝”结果见图4,18个小生境被分为5组,每组包含小生境个数和类型见表4。回归树共解释了76.59%的物种方差,说明回归树模型解释能力较好。节点(1)将18个生境分为2组(树左右两边),并解释了物种组成方差的49.76%,有机质作为树第一次划分样点的条件,说明有机质是影响样点分组和微生物分布的首要因子,节点(1)左边组与右边组分别含5个、13个生境,节点(2)以有机质为划分条件对节点(1)右边组13个生境进行分组,节点(6)和节点(12)分别以碳氮比和pH为划分条件继续对生境分组。基于MRT聚类结果,本研究将茂兰喀斯特森林小生境划分为4大类,即：石槽-石沟型,石洞-石缝型,土面表层型以及土面下层型。

表4 MRT树叶小生境分组表

3 讨论

3.1 不同小生境类型对土壤理化性质的影响

西南喀斯特山区溶蚀作用十分强烈,小生境类型多样,土壤性质因小生境环境的不同(光、热和水分条件)存在强烈异质性,且增加了在水平方向上的变异[12]。本研究显示,小生境土壤有机质变化范围在60—546 g/kg,与刘方等[13]研究结果基本一致；有机质、总碳、总氮含量表现为石槽>石沟>土面表层>石洞>石缝>土面下层,主要由于石槽、石沟、土面表层生境状态较石洞、石缝开放,使植被凋落物和雨水极易累积,凋落物的分解速率受不同小生境水热状况的影响,凋落物的分解是土壤有机质的来源,直接影响土壤有机质的含量[12,31]；土壤pH在生境中呈石缝>石洞>石槽>土面表层>石沟>土面下层的趋势,这主要是由于石缝、石洞等小生境成土过程以岩石风化为主[13],因此这两种生境类型土壤pH较其他生境高；土壤中胡敏酸含量与有机质含量呈正相关,胡敏酸含量越高,土壤pH越趋向微酸性[32],本研究中土壤有机质含量最高的石槽、石沟也表现出pH较低的特点。

3.2 不同小生境类型对土壤微生物组成的影响

研究显示,茂兰喀斯特森林小生境土壤微生物PLFA总量与细菌PLFA含量均表现为石槽>石沟>土面表层>石洞>石缝>土面下层。石沟、石槽及土面表层等生境中的植物根系及凋落物分布较其他生境多,这些物质能改变土壤的碳输入,因此石沟、石槽以及土面表层等生境中土壤微生物获得的碳源更加充沛,碳源充足的生境中,土壤微生物种类和含量较丰富。MRT分析结果显示,微生物群落组成主要受土壤有机质影响,该结果与吴愉萍[32]对土壤微生物与有机质关系研究结果一致。

真菌和放线菌PLFA含量表现为石槽>石沟>土面表层>石洞>石缝>土面下层,而真菌、放线菌与有机质、碳、氮以及碳氮比呈显著正相关。这说明有机质及氮的水平影响着真菌和放线菌的含量。另外,真菌/细菌可用于估算真菌和细菌的相对丰度,其比值的大小可指示微生物群落稳定性[33]。本研究显示,真菌/细菌变幅为0.14—0.16,其中土面表层的真菌/细菌值最大,说明土面表层的生物群落较其他生境稳定。G-是复合营养型微生物,G+是寡营养型微生物[34],G+/G-值越大,表明土壤养分越贫瘠。本研究中,G+/G-变幅为0.43—0.87,石槽的比值最小,土面下层最大,说明石槽土壤养分最丰富,土面下层养分最为贫瘠。小生境土壤营养丰富意味着微生物含量亦丰富。

微生物除了参与土壤中元素循环和能量流动外,在岩石溶蚀过程中亦具有重要功能,如微生物分泌胞外聚合物,附着在岩石表明并形成一个特殊的环境,实现矿物的溶出,而岩石溶蚀是喀斯特山区成土的重要方式；另外,生物附着于土壤中可以阻止土壤风化过程的养分淋溶作用,从而使营养元素得以保存,土壤微生物在这一过程中扮演着重要角色[35-36]。这一系列生态过程对喀斯特山区成土理论研究以及土地石漠化治理具有重要现实意义。

3.3 小生境类别划分

本研究将茂兰喀斯特森林小生境划分为石槽-石沟型、石洞-石缝型、土面表层型以及土面下层型,与廖洪凯等[12]使用冗余分析法对贵州喀斯特山区花椒林小生境分类结果较类似,但与刘方等[13]对茂兰喀斯特森林小生境分类研究结果差异较大,在刘方等人的研究中,是以小生境土壤理化因子为变量,基于欧氏距离对小生境聚类；本文运用的MRT聚类方法兼顾了小生境土壤微生物和理化因子两种变量,所含信息量大,冗余分析属约束排序范畴,侧重于对物种变量的解释,缺少对样方分类的概念[37]。因此,MRT聚类结果更为合理；另外,MRT分组结果显示了不同生境类型组合的情况,可能是因为不同生境类型土壤之间存在过渡性质。

本研究与已有研究对比发现,小生境分类结果差异较大的原因除了所用分类方法不同,还由于不同研究区域小生境外部特征差异较大引起[12-13,38],这种差异给研究者在野外布设样点和采集土样时带来困扰。目前,在针对喀斯特山区土壤的研究中,野外布设样点和土样采集往往忽视了因小生境的存在而使土壤性质存在极为强烈的空间异质性,导致布设的点和采集的样品难具代表性。为此,王世杰等[32]建议以小生境面积权重衡量某个小生境对同类型生境混合土样量的贡献,以提高土壤样品的代表性,该方法具有一定的科学性,但加大了野外工作量；另外,刘方等人[13]提出将土面和石沟的土壤代表喀斯特土壤,但其认为此方案需要深入探讨。本研究运用的MRT聚类方法,计算时纳入了土壤理化因子及微生物数据,包含样方信息量较传统聚类方法更加全面,而且能对存在过渡性质的样方进行分类[39]。因此,本研究聚类结果更为合理。从而建议以小生境组合的方式代替单独小生境类型,以供今后在喀斯特山区土壤研究布设样点和土样采集中使用,可以有效地解决上述问题。研究以单因素方差分析法分析土壤环境因子和微生物的组成差异,结果表明理化因子和微生物在土面表层和土面下层未见显著差异,但在MRT模型聚类结果中,土面表层和土面下层并未被聚为同组,加之喀斯特山区土壤浅薄不连续、分层不明显等特点,可以初步认为这两类生境的土壤理化因子和微生物极有可能存在较复杂的联系,这方面有待深入研究。

4 结论

本研究表明,贵州茂兰喀斯特森林不同小生境类型土壤理化性质存在显著地空间异质性。小生境土壤理化性质的变化使得微生物群落结构以及群落稳定性层次分明。多元回归树聚类结果表明,小生境可划分为石槽-石沟型、石洞-石缝型、土面表层型以及土面下层型四种生境类型。因此,在今后对喀斯特地区土壤微生物研究中,应充分利用现代分子生物学等技术手段加深对森林土壤微生物的研究,可在喀斯特山区生物多样性保护及石漠化治理中起到重要作用。