2017—2018年云南省边境地区阿卡斑病毒抗体检测

谢佳芮，苗海生，寇美玲，李华春

（云南省畜牧兽医科学院，云南昆明 650224）

阿卡斑病（Akabane disease）是由阿卡斑病毒（Akabanne disease virus，AKAV）引起的一种牛、绵羊、山羊胎儿先天性疾病。临床上，山羊以妊娠母羊的流行性流产，产死胎、畸形胎以及新生胎儿关节弯曲为特征。目前本病主要流行于亚洲、大洋洲、南美洲、非洲[1-5]。2012年以来，我国从10多个省市送检的1 000多份牛羊血清样品中也检出了AKAV抗体，揭示我国也存在该病[6-7]，应引起重视。带毒动物是本病的主要传染源，吸血昆虫是其传播媒介。伊蚊、三带库蚊、催命按蚊、库蠓在本病传播中起着重要作用[8]。带毒虫媒可借助风力到达不同地区，从而引起该病传播。一般动物在感染后1～6 d体温升高，发生病毒血症。在此期间，蚊蠓吸吮血液后，病毒能在蚊蠓体内增殖，当再叮咬动物时，即发生传染。垂直传播也是该病重要的传播方式，病毒可经胎盘感染胎儿。本病主要侵害反刍动物，其中牛、绵羊、山羊最易感。本病具有明显的季节性和地区性，主要发生于湿热、吸血昆虫活跃的夏秋季节，主要流行于蚊蠓滋生的热带、温带地区，特别是池塘、河流较多的低洼地区，多呈地方性流行或散发[9]。

云南省位于我国西南边陲，地理位置特殊，与周边国家乃至东南亚、南亚的其他国家和地区交往频繁，是沟通东南亚、南亚地区的主要陆上通道。由于一些东南亚国家的动物疫病防控意识薄弱，防控水平较低，再加上这些国家特殊的气候条件和地理环境，导致一些动物疫情不断发生，动物带毒情况较为普遍，尤其是由蚊虫等吸血昆虫传播的虫媒病毒。近年来，由于饮食习惯的改变，导致我国牛肉消费连年增长，以至于每年有大量牛通过口岸或边境线进入我国境内，因此云南省边境地区的虫媒病防控形势严峻。

目前我国的AKAV分布情况不清，对其危害程度了解仍不全面，这给该病防控带来了一定难度，亟需开展相关研究。为掌握云南省边境地区的牛AKAV感染情况，应用cELISA检测试剂盒，对2017—2018年采集自云南省12个边境县市的共1 860份牛血清进行AKAV抗体检测，并对检测结果进行分析，评估当地AKAV感染状况和传入风险，从而为相关防控政策研究与制定提供参考。

1 材料与方法

1.1 病例定义

1.1.1 AKAV抗体阳性个体 经cELISA 抗体试剂盒检测为AKAV抗体阳性的牛。

1.1.2 AKAV抗体阳性场 经检测，场内有 1 头或 1 头以上AKAV抗体阳性个体的牛场。

1.1.3 AKAV抗体阴性场 经检测，场内未检测到AKAV抗体阳性个体的牛场。

1.2 样本来源及抽样原则

牛血清样品随机采自云南省景洪、勐腊、勐海、孟连、沧源、镇康、耿马、芒市、瑞丽、富宁、盈江、陇川12个边境县的134个散养户、43个养殖场、34个屠宰场、40个交易市场。

按照预期流行率进行抽样。根据文献及专家建议，对存栏量大于10头的牛场（户），按照估计流行率方法采样：95%置信水平、10%预期流行率、5%可接受误差；对于存栏少于10头的牛场（户），全群采样。

共采集牛血清样品1 860份，其中2017年1 260份、2018年600份。由当地县级动物疫病预防控制中心负责样本采集，登记各区县样本数量以及样本来源、采样情况。各县样品采集数量见表1。

1.3 检测方法

采用云南省畜牧兽医科学院自行研制的AKAV cELISA抗体检测试剂盒进行检测。取出试剂盒提供的96孔ELISA板，在每个孔中加12 µL待检血清和阴性、阳性对照样品，用试剂盒提供的稀释液按1:100稀释豚鼠竞争抗体，在稀释板上按每孔50 µL加入稀释好的竞争抗体，震荡混匀；37 ℃温育1 h，用 PBST 洗液洗板3次，拍干；用稀释液按 1:1 000稀释兔抗豚鼠酶标二抗，每孔50 µL，37 ℃温育30 min，用 PBST洗液洗板5次，拍干；每孔加50 µL底物反应液，37 ℃避光温育10～15 min，然后每孔再加50 µL终止液终止反应，用酶标仪在450 nm 波长下读取结果。当阳性对照孔平均 OD ≥ 0.8，阴性对照孔OD ≤0.3时，试验结果成立，否则不成立。根据公式计算抑制率：抑制率=（1-样品OD/阴性血清OD平均数）×100%。当抑制率≥ 40%时，判为阳性；当抑制率＜ 40%时，判为阴性。

表1 各地区样品采集数量 单位：份/个

1.4 检测结果分析

采用 IBM SPSS Statistics 22 软件，对检测结果进行统计分析，用卡方检验进行数据间显著性分析，用 Excel 2007 软件统计数据。根据样品背景记录，按照采样地区、采样畜种、采样来源以及采样场点进行分类统计。

2 结果与分析

2.1 总体情况

本次检测共在1 860份血清样品中，检出抗体阳性108份，个体阳性率为5.8%（108/1 860），其中2017年为4.9%，2018年为6.3%。

2.2 地域分布

检测结果显示，AKAV在云南边境地区存在明显的地域分布差异。除瑞丽未检出阳性样品外，其他县（市、区）均检出抗体阳性，平均抗体阳性率在 0～24.4%之间，且地区间差异极显著（P＜0.01），如抗体阳性率最高的为富宁，平均阳性率为22.9%，而陇川、勐海、盈江、瑞丽2017年未检出抗体阳性，瑞丽、耿马2018年未检出抗体阳性（表2）。

表2 2017—2018年牛AKAV血清抗体检测结果统计

2.3 来源分布

按照不同来源进行检测结果统计，发现境内牛AKAV抗体阳性率为3.0%，入境牛为6.5%（表3）。利用SSPS软件进行两组阳性率数据无重复双因素方差分析，发现两组数据差异极显著（P＜0.01），入境牛的感染率显著高于境内牛。

2.4 品种分布

不同牛品种的统计结果（表4）显示，黄牛的AKAV抗体阳性率为6.4%，水牛为4.8%。利用SSPS软件进行两组阳性率数据无重复双因素方差分析，发现黄牛感染率显著高于水 牛（P＜0.05）。

表3 境内牛和境外牛AKAV抗体统计

2.5 场点类型分布

对1 860份血清样品的检测结果，按照交易市场、屠宰场，以及养殖场和村寨散养户进行归类统计。统计结果（表5）显示，来自交易市场和屠宰场以及养殖场的牛AKAV抗体平均阳性率在7.0%以上，而村寨散养户的牛AKAV抗体阳性率为2.5%。利用SSPS软件进行两组阳性率数据无重复双因素方差分析，发现交易市场、屠宰场、养殖场的牛AKAV感染率极显著高于村寨散养户（P＜0.01）。

3 讨论

这12个边境县都属于热带、亚热带气候，年均气温均在18 ℃以上，有丰富的降水，水域面积大、植被丰富，森林覆盖率高，水稻种植密度非常高。这些条件十分有利于吸血昆虫包括蚊子和叮咬蚊的生长[10-11]，同时这些县均采用圈养和放牧相结合的饲养方法，因而显著增加了媒介昆虫将病毒传播给牛的可能性。

表4 2017—2018两年不同品种牛的AKAV抗体统计

富宁县的牛AKAV抗体阳性率要比其他地区高很多，这可能是因为该县不仅气温偏高，降水量丰富，而且商品牛陆上交易路线复杂。富宁县地处“两国三省十县”结合部，既与越南接壤，国境线长75 km，有大小通道 21 条，又与广西交界，交界线长超过 400 km，通道更多。因此该地区与境外以及其他省份的牛贸易往来十分频繁。此外，随着“广昆高速公路”的全线通车，部分商贩将动物及动物产品通过高速公路直接入境或出境，逃避检疫监督[12]，因而更增加了动物及产品检疫监督工作的难度。阳性率同样较高的景洪市地理环境也很特殊，且与缅甸紧紧相连，通道较多，人员往来和边境贸易也很频繁。目前云南边境地区的外来动物以牛为主，均来自印度、孟加拉、泰国、老挝、缅甸等国，主要通过景洪市边境村的20余条民间通道进入国内[13]。

表5 不同采样地点的牛AKAV抗体统计

黄牛的AKAV抗体阳性率略高于水牛。这可能是因为云南边境地区的黄牛主要来自印度和孟加拉国，经缅甸进入我国[14]。交易市场、屠宰场、养殖场的牛AKAV感染率显著高于村寨散养户。这可能是因为屠宰场、交易市场、养殖场的牛来自境内和境外的不同地区，这样来自不同地理位置的牛在这些场所汇聚，导致感染动物与非感染动物接触机会增多，因而增大了疾病传播风险[15-17]。

AKAV可通过媒介昆虫传播，其流行规律在一定程度上取决于虫媒昆虫的活动情况[18]。我国一些省市的家畜血清学调查结果显示，AKAV在国内已有流行，且毒株来自于境外[6-7]，因此我国防堵境外AKAV流行毒株的任务越来越重要。但我国对AKAV等动物虫媒病毒的研究相对滞后，对AKAV分布和流行情况缺乏系统研究，这给AKAV防控带来较大困难。

为了提高检测敏感性，本研究将病例定义为检测出1份阳性样品的场即为阳性场。因为本研究目的是了解云南边境地区牛AKAV血清学阳性率，所以只要检出阳性样品，就将该场认定为阳性场。本研究是在 2017—2018年的6—10月进行的，当时这些地区还未开展AKAV疫苗免疫，因此检测出抗体阳性即视为存在病毒感染。本研究将边境地区有一定规模（≥10头）的牛场（户）作为研究目标群，经抽样检测发现，场群流行率为31.1%，说明病毒污染面较广。本研究采样点位于云南省边境地区。这些地区均属热带、亚热带地区，年平均气温在18 ℃以上，年降雨量在1 000 mm以上。这种高热高湿的气候条件适于库蠓、蚊虫的生长和繁殖，易于AKAV传播[19]。据有关资料[20]记载，在云南省仅吸血库蠓就有 34 种。

边境各县是云南省牛的主要产地。随着经济发展，人民生活水平提高、肉食品种增多，国内对牛、羊肉的需求量大幅提升，牛羊供不应求，导致价格快速上涨。在价格利益的驱动下，每年有大量偶蹄动物非法入境，海关部门虽然加大了监管力度，但因边境线长，山水相联，无天然屏障，流通渠道多，导致AKAV向我国内地扩散的风险持续加大。

为保护我国畜牧业健康发展，对于AKAV抗体阳性率高的地区，建议继续加强养殖场、屠宰场、牲畜交易市场管理，同时加大对牛群免疫和检疫工作的监督管理，降低饲养密度，隔离病畜，加强生物安全，适时进行疫苗免疫接种，提高AKAV的免疫密度和抗体水平；严控边境地区易感动物的无序流动，降低境外AKAV对国内家畜的威胁。对于AKAV抗体阳性率低的地区，也应采取生物安全措施，隔离、淘汰病畜，加强监测。在引种/引进精液前，需要进行AKAV抗体/抗原检测，不从高风险地区牛场调入牛只。另外，夏、秋是AKAV高发季节，可以要求养殖场、屠宰场、交易市场以及散养户采取灭蚊措施，减少叮咬蚊虫数量。同时应进一步规范牛羊定点屠宰监管，大力推进活畜集中屠宰和冷鲜冷链上市，严格活畜调运监管。加强AKAV防控知识的宣传教育，加强蚊虫AKAV携带情况以及畜间感染监测，进一步掌握该病毒的分布特点和临床特征并确定传播媒介蚊种，为本病防治提供科学依据。

4 结论

本研究通过随机抽样方法，在云南边境12县（市、区），抽取134个 散养户、43个养殖场、34个屠宰场、40个交易市场进行AKAV血清学检测，发现边境地区普遍存在AKAV感染；就采样地区、采样场点、采样牛品种，以及牛来源进行分类统计发现，不同地区的AKAV抗体阳性率高低不一，且感染区域有扩大趋势，入境牛感染率显著高于境内牛，交易市场、屠宰场、养殖场的牛AKAV感染率显著高于村寨散养户。分析认为，血清抗体阳性率的高低主要受入境动物影响，因此建议加强边境地区牛贸易的检疫监管，加大AKAV监测力度，进一步掌握AKAV的流行状况及其流行特点，保障我国畜牧业健康发展。