基于纳米磁微粒化学发光技术的S100B蛋白新型检测试剂和仪器的研究

代 晨，王 琦，江继鹏，杜振华，汪云峰，陈凯歌，陈旭义，战 丽，张 赛*，靳 颖*

（1.武警后勤学院附属医院脑科中心，武警部队脑创伤与神经疾病研究所，天津市神经创伤修复重点实验室，天津 300162；2.武警北京总队十二支队卫生队，天津 300481；3.武警后勤学院附属医院检验科，天津 300162；4.博奥赛斯（天津）生物科技有限公司，天津 300300；5.武警后勤学院救援医学系，天津 300162；6.武警后勤学院教学考评中心，天津 300162）

0 引言

S100B蛋白是一种钙离子结合蛋白，主要分布在中枢神经系统的星形胶质细胞及周围神经系统的雪旺细胞中[1]，被认为是脑的特异性蛋白[2]。正常情况下，S100B蛋白很少出现在血液中，颅脑创伤后，S100B蛋白释放至细胞外间隙，并通过受损的血脑屏障进入脑脊液和血液[3]。S100B蛋白在监测颅脑创伤发展进程[4-5]、鉴别颅脑创伤严重程度[6-7]、颅脑创伤的阴性排除[8-9]等方面具有重要的临床价值。

S100B蛋白的血清学检测方法包括放射免疫分析法、免疫放射测定法、酶联免疫吸附法、电化学发光法等，目前以酶联免疫吸附法为主，但是此方法操作复杂、耗时长、自动化困难，制约着S100B蛋白在临床的广泛应用。基于纳米磁微粒化学发光技术的S100B蛋白检测方法具有操作简单、检测速度快、可实现自动化等优点。目前国内此类检测试剂的相关报道较少，因此本文研发了相关检测试剂和仪器。

1 方法

1.1 试剂制备

1.1.1 原理

磁微粒是磁性纳米粒子与无机或有机分子结合形成的可均匀分散于一定基液中具有高度稳定性的胶态复合材料，可通过活性基团将免疫检测中的酶、抗体等相关成分固定于其表面。纳米磁微粒化学发光免疫分析技术是以化学发光剂为底物的酶免疫技术，同时应用了纳米级磁性微粒做固相载体，增加了吸附面积，使抗原、抗体最大限度结合[10]，并使其结合反应在近似液相的条件下进行，兼具化学发光与酶免疫技术的优点。在反应过程中引入生物素-亲和素系统，即夹心法纳米磁微粒化学发光技术。夹心法纳米磁微粒化学发光技术的原理（如图1所示）：待测抗原同生物素标记的抗体及酶标抗体结合形成“三明治”结构的复合物。随后加入连有亲和素的磁微粒，通过生物素-亲和素特异性结合使抗原、抗体复合物连接到磁微粒上，在外加磁场中直接沉淀，将免疫反应形成的复合物与其他物质分离。去上清后，清洗沉淀的复合物，加入酶促化学发光底物。底物在酶作用下被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时发出光子，通过光量子阅读系统记录光子强度，经过计算机处理系统将光能量强度在标准曲线上转换为待测抗原的浓度，并报告结果。

图1 夹心法纳米磁微粒化学发光技术检测原理

1.1.2 制备

试剂包括R1、R2、R0试剂和校准品。

R1[生物素（Biotin）-S100B 蛋白单克隆抗体]试剂的制备：将S100蛋白单克隆抗体用0.02 mol磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH=8.0）进行透析，4℃过夜，然后收集抗体，测OD280吸光度值，计算抗体的浓度；将水溶性的Biotin用纯化水稀释至1 mg/ml；将S100B蛋白抗体与Biotin按照质量10∶1的比例进行混合，混匀后4℃反应30 min；将偶联后的抗体用0.02 mol PBS（pH=7.4）透析过夜，每2 h换液1次，透析3次；收集偶联物，测OD280吸光度值，计算偶联后的浓度；将交联后的复合物Biotin-S100B蛋白单克隆抗体用R1稀释液配制成5 μg/ml。

R2[辣根过氧化物酶（HRP）-S100B 蛋白抗体]试剂的制备：称取5 mg HRP溶解于1 ml蒸馏水中，再加入0.2 ml新配的0.1 mol NaIO4溶液，室温下避光搅拌20 min；将上述溶液装入透析袋中，用1 mmol pH 4.4的醋酸钠缓冲液进行透析，4℃过夜；加20 μl 0.2 mol pH 9.5的碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入5 mg S100B蛋白抗体在1 ml 0.01 mol碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2 h；加0.1 ml新配的4 mg/ml NaBH4液后混匀，4℃下静置2 h；将上述液体装入透析袋中，用0.15 mol pH 7.4的PBS进行透析，4℃过夜；进行收集，测定偶联复合物的蛋白浓度；用R2稀释液将HRP-S100B蛋白抗体复合物配制成0.5 μg/ml。

R0试剂的制备：链霉亲和素与粒径1 μm的羧基磁珠通过碳二亚胺（EDC）交联剂，按照10 mg磁珠交联0.3 mg链霉亲和素的比例，交联后用R0稀释液将交联后的磁珠稀释至0.5 mg/ml。

校准品的制备：用校准品稀释液稀释S100B蛋白抗原，制备校准品。

1.2 仪器

1.2.1 原理

化学发光免疫分析仪包含免疫反应系统和化学发光分析系统2个部分。免疫反应系统是将发光物质（在反应剂激发下生成激发态中间体）直接标记在抗原或抗体上。化学发光分析系统在临床检验和医学实验室有广泛的应用[11]，利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成激发态中间体,当这种激发态中间体回到稳定的基态时发射出光子，采用光电倍增管，由单光子计数器检测并传输至放大器，并加高压电流放大，放大器将模拟电流转化为数字电流，数字电流将发光信号由数据线传输给计算机，根据标准品建立的数学模型对样品中的待测物浓度进行定量分析,经过软件处理转换成待测物浓度。不使用任何光源，避免了背景光和杂散光的干扰，降低了噪声，提高了信噪比，可测定纳克级或皮克级化学成分。同时开发设备的管理与控制软件，采用Windows界面风格，与实验室信息系统（laboratory information system，LIS）进行交换和共享数据。

1.2.2 构造

检测仪器主要由试剂模块、反应模块、清洗模块、检测模块4个部分组成，具体由试剂盘、样本盘、磁微粒盘、装载台、反应盘、清洗盘和检测盘构成，如图2~4所示。

图2 S100B蛋白检测仪器实物图

试剂模块包括试剂盘、样本盘和磁微粒盘。试剂盘用于存放试剂，提供2~8℃冷藏环境，具有试剂扫描定位功能；可以实现 360°旋转，能同时容纳30组试剂位；由步进电动机驱动，传动结构为同步带传动，精度高、成本低；可以灵活取下，方便试剂保存。样本盘用于存放待测样本，可以自动检测标本中的凝块并探测液面高度；最多支持6个样本架，均可作为急诊样本架，每个样本架可装载10个样本，支持原采血管上机；能够实现360°旋转，由步进电动机驱动，传动结构为齿轮传动，精度高、寿命长；样本针和试剂针双针一体，位于样本盘和试剂盘中间，分别用于吸取样本和试剂。磁微粒盘用于存放磁微粒，仪器运行时，自动混匀磁微粒，其中外圈有8个小磁珠位（12 ml），内圈有1个大磁珠位（120 ml）；结构紧凑，采用行星齿轮结构，实现8组磁微粒在机混匀，同时参与试剂匹配，中间大容量磁微粒可以满足多种试剂需要。

图3 S100B蛋白检测仪器各部件示意图

图4 S100B蛋白检测仪器结构原理图

反应模块包括装载台、反应盘。装载台内置反应管，样本、试剂和磁微粒在此处混合，共有2个反应杯盒，每个反应杯盒装载96个反应管；具备位置记忆、夹管探测及自动跳转功能，包括X轴移动机构、Y轴移动机构和抓手三大部分。反应盘用于抗原、抗体和磁珠的孵育，共有90个反应位，具有气浴恒温结构[（37±0.5）℃]、被动旋转混匀结构；由步进电动机驱动，利用同步带结构实现精准定位；同时在线容纳90个孵育位，37℃精确控温，实现全天在机稳定性8%以内。

清洗模块由清洗盘构成。将含有磁微粒子的试剂和待测物形成的复合物从液体中分离出来，依靠永磁铁吸附磁珠，避免磁珠的损耗；清洗时自动抖动旋转，保证充分清洗；末端装载有底物注液针，方便将底物加入清洗盘。清洗盘由转盘、进液吐液结构、磁铁3个部分组成，转盘负责传动反应杯，进吐液结构负责抽取废液和吐出洗液，磁铁部分负责收放磁微粒。

检测模块由检测盘构成，用于标本的检测，具有密闭的温控结构设计，可以实现恒温检测；具有独特的回形避光结构，同时采用知名品牌检测单元，检测数据精准。

1.2.3 主要技术指标

（1）反应区温度控制的准确性和波动度：反应区温度控制在（37±0.5）℃范围内，波动度不超过1.0℃。（2）稳定性：开机处于稳定工作状态后，第4小时、第8小时的测试结果与处于稳定工作状态初始时的测试结果的相对偏倚不超过±10%。批内测量重复性[变异系数（coefficientofvariation，CV）]≤8%。（3）线性相关性：在不小于2个数量级的浓度范围内，线性相关系数r≥0.95。（4）携带污染率：≤10-5。（5）工作条件：电源（220±22）V，（50±1）Hz；功率 1 500 W；环境温度10～30℃；相对湿度≤80%；大气压力85.0～106.0 kPa。

1.2.4 检测流程

该仪器检测血清S100B蛋白的流程（如图5所示）如下：（1）在装载台的反应管中加入样本，加样步骤为：R1试剂50μl+样本或校准品25μl+R2试剂50μl，在37℃条件下反应10min；加入R0试剂50 μl，在37℃条件下反应5min。孵育过程在反应盘中进行。（2）孵育成功后，在清洗盘中利用磁分离技术反复清洗3次，将磁微粒-S100B蛋白复合物与液体环境分开，达到彻底清洗的目的。（3）加入发光底物液A、B各100 μl，产生光子，通过单光子计数器进行检测，30s后读取发光值，计算S100B蛋白的含量。

图5 检测流程图

2 结果

2.1 试剂

基于纳米磁微粒化学发光技术研制了检测血清S100B蛋白的试剂。该试剂具有以下几个特点：（1）利用顺磁铁微粒为固相载体，外包被单克隆抗体，增加抗原、抗体的接触面积及底物发光面积，提高反应灵敏度；采用旋转磁场使磁微粒-S100B蛋白复合物与杂质分离，具有分离速度快、效率高、可重复性好的特点。（2）使用单克隆抗体，提高反应的特异性。引入的生物素-亲和素系统具有多级信号放大作用，不增加非特异性干扰，具有特异性好、稳定性高、实用性强、实验成本低的优点。（3）在液相反应中，使用发光增强剂，将水分子从发光底物的发光位点排开，减少干扰，同时还可缩短发光的达峰时间，提高检测速度。（4）该检测方法所需标本量少，磁微粒绿色环保，无放射性污染。

2.2 磁微粒全自动化学发光免疫分析仪器

设计并制造了磁微粒全自动化学发光免疫分析仪器，该仪器有自动稀释、准确加样、恒温反应等功能，可满足随机、批量、急诊检测模式；具有反应盘被动混匀结构，利于抗原、抗体和磁珠的孵育；具有清洗位旋转震荡清洗功能，使清洗更彻底，检测结果更准确；具有样本针、试剂针双针设计，凝块和液面自动探测，试剂恒温冷藏等多种功能；设备的管理与控制软件稳定性强、操作简单、扩充性强，符合实验室的业务工作流程需要。

2.3 临床实验

选取2017年12月至2018年2月某医院16例颅脑创伤住院患者，入院即刻采集患者静脉血4 ml，3 000 r/min离心10 min，获得血清样本，每例样本分为2份，分别采用本文研究的试剂和检测仪器（方法一）、罗氏S100B蛋白检测试剂和Elecsys2010设备（方法二）进行测试，结果见表1。使用Pearson相关系数分析2种检测方法的相关性（如图6所示），r值为 0.959，P＜0.01，2种测试方法相关性好。

表1 2种方法检测S100B蛋白结果ng/ml

图6 2种检测方法检测S100B蛋白的相关性

3 结语

S100B蛋白对颅脑创伤的诊断有重要参考价值，可以优化该类患者的检查流程，减少轻型颅脑创伤患者接受辐射的剂量，节约医疗资源，降低医疗费用。在瑞典，S100B蛋白被纳入颅脑创伤指南：低风险轻型颅脑创伤患者受伤6 h内，如血清S100B蛋白＜0.1 ng/ml，可先进行临床观察[8]。美国急诊医师学会的指南亦推荐，创伤后4 h内血清S100B蛋白＞0.1 ng/ml为头颅CT检查的最佳适应证[12]。国内研究也表明，血清S100B蛋白含量越高，颅脑创伤越严重，预后越差，血清S100B蛋白测定可作为判断颅脑创伤严重程度及预后的重要指标，具有重要的临床应用价值[13]。基于纳米磁微粒化学发光免疫分析技术的S100B蛋白检测方法具有灵敏度高、特异性强、线性范围宽、简单快速、可重复性好、安全无毒等优点；检测仪器稳定可靠，可以提供样本的快速、批量检测，自动化程度高。尽管该检测目前尚未被广泛应用于临床工作中，但相信该检测试剂及仪器的国产化，可以为临床诊断和科研工作提供可靠的检测方法。