PI3K信号通路激活对PCOS大鼠生殖相关内分泌指标的影响

李 曼，刘春丽，毛红梅，徐淑琴

多囊卵巢（PCOS）属内分泌紊乱综合征，临床多伴随卵巢多囊样改变、稀发排卵或不排卵、胰岛素抵抗（IR）等症状[1]。其发病机制尚未完全明确，多认为IR参与其发病过程[2]。PI3K途径是与细胞内糖代谢密切相关的信号通路，PI3K信号磷酸化减少为PCOS出现IR的重要特征。动物实验证实，利拉鲁肽可通过降低PI3K抑制剂对PI3K通路的抑制影响，发挥神经细胞保护作用[3]。但目前对利拉鲁肽对PCOS的治疗作用了解尚少，对其确切作用机制及对PI3K通路的影响尚未完全明确。基于此，本研究建立PCOS大鼠模型，并给予利拉鲁肽干预，旨在研究利拉鲁肽对PI3K信号通路的影响及其调节PCOS大鼠生殖内分泌的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 由湖北省实验动物研究中心提供的清洁级SD雌性大鼠[SCXK(鄂)2013-0016]，体质量190～210 g，自由摄食、水，自然光照，室温 23 ℃，光照周期12 h明/12 h暗，适应性喂养1 w。

1.2 主要试剂与仪器 利拉鲁肽注射液（丹麦Novo Nordisk A/S 公司），DHEA（美国 IL 公司）；Western blot试剂盒（Fermentas公司），RT-PCR 试剂盒（ToYoBo公司），Trizol试剂盒、cDNA 逆转录试剂盒，P、T、E2酶联免疫试剂盒（Invitrogen公司）；Light Cycler480型RT-PCR仪，Imark全自动酶标仪（基因有限公司）。

1.3 分组、建模及给药方法 将30只SD健康雌性大鼠随机分为参照组、模型组与干预组，各10只。除参照组外，均采用DHEA法建立PCOS大鼠模型[6]：每日自大鼠颈背部皮下注射DHEA 600 mg/100 g，连续21 d，见大鼠体重增加，阴道涂片动情周期消失，血清雄激素、黄体生成素升高，卵巢体积增大，卵巢组织呈多囊样改变，为造模成功[7]。干预组在造模成功后，自颈背部皮下注射利拉鲁肽0.4 mg/kg，1次/d；参照组和模型组注射同等量生理盐水，两组均持续给药16 w。期间所有大鼠正常摄食饮水。

1.4 标本采集 干预结束后，各组均空腹10 h，次日清晨采用10%水合氯醛麻醉大鼠，快速心脏取血，离心后低温冷藏备用；取双侧卵巢组织，右侧卵巢采用多聚甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚度连续切片，行HE染色及免疫组化观察；左侧卵巢组织用无菌生理盐水冲洗，冷冻储存，备用。

1.5 检测指标

1.5.1 卵巢组织形态学 对卵巢组织切片后进行染色，镜下观察卵巢组织形态变化。

1.5.2 激素和血糖 以酶联免疫法测定大鼠血清孕激素（P）、睾酮（T）水平，以氧化酶法测定空腹血糖（FPG）水平。

1.5.3 卵巢组织PI3K mRNA 提取大鼠卵巢组织总RNA，进行纯度、浓度鉴定，逆转录制备cDNA，采用RT-PCR法测定卵巢组织PI3K mRNA水平。

1.5.4 卵巢组织PI3K信号通路各分子蛋白表达水平 以Western blot法测定卵巢组织PI3K信号通路相关分子AKT、p-AKT蛋白表达水平。取冰冻卵巢组织，解冻研磨，充分裂解，12 000 r/min离心10 min，获取蛋白提取液；加蛋白上样液，凝胶电泳、转膜，脱脂奶粉封闭；加一抗孵育过夜，洗膜，加过氧化物标记二抗，孵育60 min，洗膜3次×5 min，X光片显影，计算机摄像，采用全自动凝胶成像系统分析条带，以目的条带、内参条带光密度比值为蛋白表达量。

1.6 统计学方法 应用SPSS 20.0统计软件分析，计量资料以±s表示，多组比较行方差分析，组内比较进行LSD-t检验；计数资料以频数和百分率表示，采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠卵巢组织形态观察 参照组卵巢组织切片HE染色见不同发育阶段卵泡，见多个黄体，颗粒细胞层约为8～9层，且细胞形态完整，排列整齐、紧密，卵泡膜细胞层薄，为1～2层（图1a）；模型组卵巢结构紊乱，近包膜下见多个囊性扩张卵泡，部分卵泡内无卵母细胞，且放射冠消失，可见颗粒细胞层数减少，少见黄体（图1b）；干预组颗粒细胞层较模型组增多，卵泡膜细胞层变薄，见成熟卵泡，黄体数量较模型组多（图1c）。

2.2 各组激素和血糖水平比较 参照组与干预组血清P和FPG水平比较无显著差异，且均与模型组比较有显著差异（P＜0.05）；3组血清T水平大小顺序为参照组＜干预组＜模型组（P＜0.05，表1）。

表1 各组激素和血糖水平比较（n=10）

图1 各组卵巢组织形态结构（HE×100）

2.3 各组卵巢组织PI3K mRNA水平比较 模型组PI3K mRNA、AKT蛋白、p-AKT蛋白表达水平低于参照组与干预组（P＜0.05）；干预组仅PI3K mRNA表达水平高于参照组 （P＜0.05），而AKT蛋白和p-AKT蛋白表达水平与参照组相近（P＞0.05）。见表2。

表2 各组卵巢组织Pl3KmRNA表达和AKT及p-AKT蛋白表达水平比较（n=10）

3 讨论

PCOS患者不仅生殖功能异常，且伴有糖耐量降低、糖脂代谢异常等内分泌代谢紊乱表现，远期易出现IR、糖尿病及心血管疾病[4]。研究认为，PCOS患者普遍存在选择性IR，主要体现在胰岛素信号转导异常、信号通路代谢途径缺陷等[5]。

PI3K是具备特异性催化磷脂酰肌醇脂物质的激酶类型，有脂类激酶及丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性，可被络氨酸与非络氨酸激酶受体等细胞因子受体活化[6]。PI3K信号通路是与细胞内糖代谢调节紧密关联的信号途径，而PI3K途径磷酸化减少则为PCOS胰岛素抵抗的主要表现，可直接导致信号通路中断，引起与染色体遗传物质变异相关疾病，直接影响人体生理功能及发育进程[7]。本研究采用DHEA法建立PCOS大鼠模型，结果发现，与参照组比较，PCOS模型组卵巢组织PI3K mRNA表达水平明显降低，且与PI3K信号通路相关蛋白p-AKT表达水平也降低，表明PCOS大鼠存在明显胰岛素PI3K信号通路异常表现。

本研究还发现，模型组P水平较参照组更低，而T、FPG水平较参照组更高，证实PI3K信号通路异常与PCOS卵巢激素合成存在密切联系，该通路信号磷酸化异常是导致PCOS并发高雄激素血症的重要原因，且PCOS胰岛素抵抗与高雄激素血症形成恶性循环，进一步影响其卵巢功能[8]。因此，必须重视改善其IR，实现促排卵。胰高血糖素样肽-1（GLP-1）则为进食后远端肠腔L型细胞所分泌的肠促胰素，其与GLP-1受体结合后可降低胰高糖素分泌，刺激迷走神经，控制食欲及饱腹感，延迟胃排空，降低体重，早期被证实在2型糖尿病（T2DM）治疗中有肯定的效果[9]。利拉鲁肽则为临床常用GLP-1类似物，可有效降低T2DM患者FPG、餐后2 h血糖及糖化血红蛋白，同时改善患者胰岛β细胞功能，且减重效果明显。

本研究还发现，干预组颗粒细胞层增多，成熟卵泡、黄体数量较模型组多，考虑是因为利拉鲁肽干预可通过激活PI3K通路，调节甾体激素合成酶表达，降低卵巢颗粒细胞睾酮合成能力，抑制高雄激素血症，上调孕激素表达，促进卵泡发育，同时抑制胰岛β细胞凋亡，改善胰岛细胞功能，纠正PCOS胰岛素抵抗及糖代谢紊乱[10]。

综上所述，利拉鲁肽可通过激活PI3K信号通路，调节甾体激素合成酶表达，抑制雄激素表达，改善PCOS胰岛素抵抗，调节其糖代谢，促进卵泡发育。