不同液体复苏方式未改善脓毒症大鼠心肌线粒体功能

丁 丁，胡 艳，张 敏，刘 念

（1安徽医学高等专科学校基础部；2安徽医科大学第一附属医院重症医学科，安徽合肥 230022）

心肌功能障碍是脓毒症患者常见的并发症，死亡率高达40%[1]，心肌线粒体是重要的损伤目标[2]，在脓毒症中心肌线粒体功能障碍可导致心肌受损，进而导致心力衰竭[3]。但是由于导致心肌线粒体功能障碍的机制复杂，目前缺乏有效的靶向治疗。液体复苏广泛用于脓毒症患者的早期干预，主要复苏液体包括乳酸林格氏液(RL)、生理盐水(NS)和白蛋白(ALB)。然而，选择何种液体进行液体复苏仍存在争议[4-8]。本文研究了不同复苏液进行液体复苏时脓毒症大鼠的心肌损伤的保护作用和心肌线粒体功能的动态变化，并研究了不同复苏液对心肌线粒体功能的影响。

1 方 法

1.1 实验大鼠

清洁级雄性成年Sprague-Dawley（SD）大鼠180只，体重（213.58±20.74）g，由安徽医科大学实验动物中心提供，动物质量许可证号：SCXK（皖）2015-02。

1.2 脓毒症大鼠模型的制备及分组

180 只SD 大鼠随机分为组(每组12 只)。使用10%水合氯醛(10 mg/kg)通过腹腔注射将实验大鼠完全麻醉。对照组只接受开腹和关腹治疗。实验组用盲肠结扎法制备脓毒症大鼠模型，盲肠结扎法致病菌具有多样性，包括兼性厌氧菌、革兰阳性菌、酵母菌、肠厌氧微生物等，与人类脓毒症致病菌类似，能够较好的反映脓毒症的病理生理过程。试验组随机分为脓毒症组(无复苏液体)、乳酸林格复苏组(RL组)、生理盐水复苏组(NS 组)和白蛋白复苏组(ALB组)。使用微型泵通过右股静脉插管在复苏组中制备脓毒症模型后1 h 开始进行液体复苏。对照组和试验组随后根据时间以12 h、24 h 和48 h 为节点进行研究。12 h RL 组、NS 组和ALB 组的大鼠分别接受10 mL/kg/h RL、10 mL/kg/h NS 和3 mL/kg/h ALB(5%)，进行连续12 h 液体复苏。24 h RL 组、NS 组和ALB 组大鼠在术后分别接受10 mL/kg/h RL、10 mL/kg/h NS 和3 mL/kg/h ALB，进行连续24 h 液体复苏，48 h RL 组、NS 组和ALB 组大鼠在术后分别接受15 mL/kg/h RL、15 mL/kg/h NS和5 mL/kg/h ALB，进行连续48 h液体复苏。

1.3 标本收获

对照组和试验组大鼠在相应的时间点(12、24和48 h)被处死后，从大鼠左心室采集心肌组织。

1.4 实验方法

一般观察：三名对不知道特定分组情况的研究人员观察所有大鼠的一般状况，并测量大鼠的心率和体温。另一名研究人员负责分析数据并观察实验大鼠出现精神萎靡、全身颤抖、行走不稳、腹胀腹泻等症状，为脓毒症造模成功。心肌被固定在10%多聚甲醛中，脱水，并包埋在石蜡中，切割厚度为5 μm的石蜡切片，放在载玻片上，用苏木精伊红（HE）染色以进行光学显微镜观察。凋亡的心肌细胞被观察到是整个心肌区域的空泡化区域。组织病理学变化按0～4的等级评分如下:0=正常；1=最小损坏；2=轻微损坏；3=中度损坏；4=严重损坏。三名从事组织病理学工作超过10 年的病理医师被要求同时进行组织病理学检查并给出相应的分数，平均值被计算为最终的病理分数。

心肌线粒体功能的测量:用4 ℃生理盐水不间断冲洗掉心脏各腔室及大血管的血液，用滤纸反复吸干心脏上的水分后在天枰上称重。在左心室取约250 mg心肌组织。心肌组织切碎后在4 ℃介质（0.25 mol/L蔗糖、10 mmol/L Tris-HCl，pH7.4，0～4 ℃）中制备心肌组织匀浆。匀浆经750 g、离心10 min后留上清，以9 000 g 离心20 min 后留沉淀，重新悬浮后以9 000 g再离心20 min，弃上清得线粒体，全部操作于4 ℃进行。心肌线粒体悬浮液的纯度为17～20 mg/mL。用流式细胞术(FCM)测量线粒体膜电位，并用FL-1通道的荧光强度/FL-2通道的荧光强度进行评估[9]。激发波长设置为488 nm，FL-1 通道的最大发射波长为580/590 nm，FL-2 通道的最大发射波长为510/527 nm，并使用Cell Quest 软件分析图像。ATP可以分解成ADP 和无机磷，因此，并用分光光度法测定无机磷含量评价线粒体Ca2+-Mg2+-ATPase 活性。线粒体呼吸链复合体I 和II 的活性用比色定量法[10]测量。线粒体呼吸链复合体I 活性随着氧化后NADH峰值水平的降低而被评估。线粒体呼吸链复合物II 活性在还原后随着二氯酚-吲哚酚峰值水平的降低而被评估。

1.5 统计分析

2 结果

2.1 一般情况

所有的实验大鼠在实验过程中均未死亡。实验组大鼠术后12 h 出现脓毒症症状，例如心率和呼吸频率加快、体温升高、精神反应不良、食欲不振和体重减轻，超过一半出现出血倾向和腹泻症状。这些结果表明，实验组成功建立了脓毒症模型。对照组大鼠则未出现心率和呼吸频率没有加快，体温上升，精神反应不良，食欲不振和体重减轻症状。在相应的时间点，每个研究分组中复苏液的平均量见表1。

表1 不同组复苏液的平均量

2.2 心肌组织病理学观察

苏木精伊红（HE）染色法对照组心肌纤维条纹清晰，无明显变性和坏死，心肌间质无明显改变(图1A)。脓毒症组和复苏组心肌组织发生炎症反应，部分心肌细胞发生变性和局灶性坏死，尤其是24和48 h(图1B、1C和1D)。组织病理学评分显示48 h脓毒症组＞24 h 脓毒症组＞12 h 脓毒症组＞对照组[(3.19±0.21)vs(2.04±0.17)vs(0.96±0.13)vs(0.11±0.07)，均P＜0.05]。

图1 大鼠心肌组织病理切片箭头所示为心肌细胞变性和局灶性坏死

2.3 心肌线粒体功能

表2 各组大鼠心肌线粒体膜电位比较(±s)

表2 各组大鼠心肌线粒体膜电位比较(±s)

注：a 与对照组比较，P＜0.01；b 与12 h 脓毒症组比较，P＜0.05

与对照组相比，脓毒症大鼠24 h 和48 h 的心肌线粒体膜电位降低(P＜0.01)，24 h和48 h非复苏组的膜电位低于12 h非复苏组(P＜0.01)，48小时非复苏组的膜电位低于24 h 非复苏组(P＜0.05)（见表2，图2）。

表3 各组大鼠心肌线粒体Ca2+-Mg2+-ATP酶活性比较(±s)

表3 各组大鼠心肌线粒体Ca2+-Mg2+-ATP酶活性比较(±s)

注：a 与对照组比较，P＜0.05；b 与12 h 脓毒症组比较，P＜0.05；c 与12 hRL 组比较，P＜0.05；d 与12 NS 组比较，P＜0.05；e与12 hALB组比较，P＜0.05

与对照组相比，脓毒症大鼠12 h、24 h和48 h的Ca2+-Mg2+-ATPase 活性降低(P＜0.01)，24 h 和48 h非复苏组的Ca2+-Mg2+-ATPase活性低于12 h非复苏组(P＜0.05)，48 h非复苏组的Ca2+-Mg2+-ATPase活性低于12 h和24 h非复苏组(P＜0.05)（见表3，图3）。

表4 各组大鼠心肌线粒体呼吸链复合物I活性的比较(±s)

表4 各组大鼠心肌线粒体呼吸链复合物I活性的比较(±s)

注：a 与对照组比较，P＜0.01；b 与12 h 脓毒症组比较，P＜0.05；c与12 hRL组比较，P＜0.05；d与12 h NS组比较，P＜0.05；e与12 hALB组比较，P＜0.05

与对照组相比，脓毒症大鼠在12 h、24 h 和48 h的复合物I活性降低(P＜0.01)，24 h和48 h非复苏组的复合I 活性低于12 h 非复苏组(P＜0.05)（见表4，图4）。

表5 各组大鼠心肌线粒体呼吸链复合物II活性的比较(±s)

表5 各组大鼠心肌线粒体呼吸链复合物II活性的比较(±s)

注：各组均无显著差异

与对照组相比，脓毒症大鼠的复合物II 活性没有降低(P＞0.05)（见表5、图5）。同一时间点，非复苏组和复苏组的心肌线粒体膜电位和Ca2+-Mg2+-ATPase、复合物I 和II 的活性没有统计学差异(P＞0.05)（见图2～5），这表明用乳酸林格氏液、生理盐水和白蛋白复苏不会恢复心肌线粒体膜电位和Ca2+-Mg2+-ATPase和复合物I和II的活性。

图2 心肌线粒体膜电位

图3 Ca2+-Mg2+-ATPase活性（g/L）

图4 线粒体呼吸链复合体I活性(U/mg)

图5 线粒体呼吸链复合物II(U/mg)

3 讨论

液体复苏是脓毒症“Buddle化”治疗的重要组成部分，在临床工作中有着重要的地位。研究表明，脓毒症发生6 h内进行液体复苏治疗的效果最好，且在24 h内如能进行及时的液体复苏可以显著降低脓毒症的死亡率。脓毒症发生24 h内进行液体复苏可以改善严重脓毒症患者的微循环，但脓毒症持续48 h后再进行液体复苏不能改善微循环[9]。因此，在本文中选择脓毒症模型建立后的12 h、24 h 和48 h 作为观察时间点[10]。

对脓毒症患者而言，早期液体复苏是关键的干预措施。在复苏液体的选择上，晶体液具有价廉、保质期长并且能够较好的达到复苏目的等优势，一般作为复苏液体的首选，渗透性和电解质组成的不同晶体液会对肌体的内环境造成不同影响，相比较而言，因为生理盐水本身的“非生理性离子配比”，故而乳酸林格液更有优势[11]。乳酸林格液作为性质上最相似的细胞外液，广泛用于液体复苏。乳酸有L型和D型两种异构体。D型乳酸会引起中性粒细胞(PMN)的活化，这可能导致组织损伤。L型乳酸能降低PMN的活化，因此具有免疫保护作用。白蛋白作为胶体液的代表性药物之一，其能够迅速的恢复血容量，改善微循环灌注，但并不能降低脓毒症患者的病死率，目前的研究认为没有一种液体是最理想的复苏液体[12]。

一般认为在发生严重脓毒症时心肌细胞线粒体膜电位会明显降低，是由于此时过氧化物和一氧化氮（NO）等抑制电子传递链复合物活性和诱导解耦联蛋白的活性增强，从而使质子泵出减少和加剧线粒体质子泄漏，最终使线粒体膜电位下降、ATP生成减少；而线粒体膜电位降低与线粒体膜通透性改变密切相关。一般认为液体复苏能够起到改善微循环、减轻血管内皮细胞损伤、改善血管通透性等一系列积极的作用，液体复苏是脓毒症和脓毒症休克的基础组成部分。我们的结果证实了持续的液体复苏能够维持脓毒症大鼠的平均动脉压，保证体循环的稳定，但在持续复苏的过程中心肌线粒体功能仍呈现出了时间依赖性的损害，而且采用不同时长和复苏液进行不同方式的液体复苏均未没有起到保护脓毒症大鼠心肌线粒体功能、改善脓毒症大鼠的心肌线粒体功能障碍的目的，提示导致线粒体功能损害的微循环障碍和平均动脉压所代表的体循环之间还存在着诸多的差异。

4 结论

液体复苏能够维持脓毒症大鼠的平均动脉压，但是通过延长复苏时间和使用包括乳酸林格氏液、生理盐水和白蛋白在内的常用晶体或胶体液进行液体复苏并不能取得预期的脓毒症大鼠心肌保护作用，脓毒症大鼠的心肌线粒体功能仍呈现时间依赖性损害。虽然脓毒症液体复苏在脓毒症治疗中仍然有着重要的价值，但不具备保护心肌线粒体功能的作用，因此还需要我们从其他的方面着手进行心肌线粒体的保护工作。