Beclin-1基因沉默对蛇六谷提取物损伤胃癌SGC-7901细胞的影响*

潘 磊，胡梦奕，李 赛，陈培丰，尹利明△

(1浙江中医药大学附属第一医院， 浙江 杭州 310006； 2宁波市中医院， 浙江 宁波 315010)

蛇六谷是天南星科魔芋属的多年生草本植物的统称，又名魔芋，亦称蒟蒻、蒻头和由跋等。经考证[1-2]，浙江地区药用“蛇六谷”为花魔芋的块茎。据《中药大辞典》记载，本品性寒，味辛、苦，内服有化痰消积、解毒散结和行瘀止痛的功效，外用可解毒消肿，治疗淋巴结结核、丹毒、跌打损伤、烫火伤和蛇咬伤等。现代广泛用于治疗各种恶性肿瘤，认为其有软坚散结、清热解毒抗肿瘤的功效。我们前期筛选并研究发现蛇六谷提取物(the extract from tuber ofAmorphophalluskonjac，TuAKe)具有抑制胃癌增殖的作用[3]，且能够诱导胃癌细胞发生自噬[4]，但是机制并不明确。Beclin-1基因又称BECN1基因，是自噬信号通路的重要调节基因[5]。本研究重点探讨beclin-1基因及在蛇六谷提取物抑制人胃癌SGC-7901细胞活力的作用。

材 料 和 方 法

1 材料

人胃腺癌细胞株SGC-7901购自中国科学院上海细胞生物学研究所。慢病毒载体GV112由上海吉凯生物科技有限公司提供。DMEM 培养基购自Gibco；胎牛血清购自杭州四季青公司；CCK-8试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；抗beclin-1和LC3抗体购自Cell Signaling Technology; 凋亡试剂盒购自Invitrogen； 抗GAPDH抗体购自联科生物技术有限公司。

蛇六谷提取物由浙江中医药大学药物研究所提供，具体操作如下：取蛇六谷饮片100 g，剪成粗颗粒，用8倍体积95%乙醇浸泡过夜，回流提取2次并负压浓缩，2倍体积石油醚萃取2次，再次负压浓缩，真空干燥即为蛇六谷石油醚萃取物(蛇六谷提取物)。

2 方法

2.1制备GV112-beclin-1-shRNA慢病毒载体 GV112慢病毒载体购自上海吉凯基因化学技术有限公司。根据GenBank(NM_003766)中beclin-1基因的已知序列，选择3个靶点(256～275、654～673和807～826)，每条模板链的组成包括19个碱基正义链和19个碱基的反义链，正反链之间有6个碱基间隔，反义链之后有5个T作为转录终止信号，在模板链的两端加入AgeI和EcoR I酶切位点。2条链在退火缓冲液中，90 ℃水浴15 min，冷却至室温，通过T4 DNA ligase 将双酶切线性化的载体和退火双链DNA连接。经过转化和菌落PCR鉴定及测序，成功制备3个携带beclin-1干扰(beclin-1-RNAi)序列的慢病毒载体; scramble序列为对照序列。Beclin-1干扰序列见表1。

表1 Beclin-1干扰序列

2.2细胞培养及转染 胃癌SGC-7901细胞置于含体积分数为10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中， 37 ℃、5% CO2条件下培养。细胞贴壁生长达到70%～80%融合，将细胞分为3组：空白对照(control,CON)组、阴性对照组(NC组)和RNAi组(KD组)。取GV112-beclin-1-shRNA1和GV112-NC-shRNA慢病毒颗粒各4 μL，分别转染SGC-7901细胞，real-time PCR分析内源性beclin-1表达水平(引物序列见表2),计算敲减效率，最终确定GV112-beclin-1-shRNA1慢病毒载体。收集存活的细胞并扩增培养稳定表达的beclin-1-shRNA及NC-shRNA细胞。

2.3蛇六谷提取物处理SGC-7901胃癌细胞 取CON组、NC组和KD组的SGC-7901胃癌细胞，调整细胞密度为1×108/L，分别加入不同浓度(终浓度为25、50、100和200 mg/L)的蛇六谷提取物进行如下实验。

表2 引物序列及扩增条件

2.4CCK-8实验检测细胞活力 取各组胃癌SGC-7901细胞，以每孔100 μL接种于96板孔中，细胞密度为每孔1×104细胞，复种于6孔板中。于培养24 h、48 h、72 h、96 h和120 h后，每孔中加入CCK-8试剂10 μL，继续培养4 h，充分振荡，酶标仪检测450 nm波长的吸光度(A)值，计算各实验组细胞生长的抑制率。实验重复3次。细胞抑制率(%)=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100%。

2.5流式细胞术检测SGC-7901胃癌细胞的凋亡率 取胃癌SGC-7901细胞及beclin-1基因沉默的细胞株，以每孔3 mL接种于6孔板中，细胞密度为每孔2×105细胞，贴璧生长达到80%融合，加入不同浓度蛇六谷提取物，培养72 h。收集胰酶消化的贴璧细胞，冷PBS洗涤细胞2次，按照凋亡试剂盒说明书，依次加入Annexin V-FITC和PI染料，4 ℃孵育15 min，流式细胞术检测，每个检测标本记录 10 000个细胞。同样的实验重复3次。

2.6Western blot检测SGC-7901胃癌细胞的LC3和beclin-1蛋白的表达 蛇六谷提取物处理各组SGC-7901胃癌细胞48 h，采用细胞裂解液(含50 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、1% Triton X-100和蛋白酶抑制剂)提取总蛋白。将40 μg蛋白加入SDS凝胶加样缓冲液20 μL中，煮沸后，经SDS-PAGE分离后，将蛋白条带用电转移到NC膜上，分别加特异性的抗beclin-1和LC3抗体，4 ℃孵育过夜，加辣根过氧化物酶标记的 II 抗，经充分洗涤后用ECL发光剂。采用灰度扫描系统测定并分析目的蛋白条带。同样的实验重复3次。提取总蛋白并测定蛋白质浓度。

3 统计学处理

用SPSS 17.0统计软件进行统计分析。计量资料采用均数±标准差(mean±SD)表示。多组均数比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 敲减beclin-1基因对胃癌 SGC-7901细胞beclin-1表达的影响

将KD和NC组的慢病毒颗粒转染SGC-7901细胞，NC组慢病毒携带scrambled序列，未转染慢病毒的细胞为空白对照组(CON组)。KD组(含3个干扰序列)beclin-1的mRNA 相对表达量分别为0.08±0.01、0.16±0.01和0.27±0.01；NC组和CON组beclin-1的mRNA 相对表达量分别为1.00±0.01和1.13±0.01。KD组beclin-1的mRNA和蛋白相对表达量均低于NC组和空白CON组(P<0.01)，3个干扰序列(KD1、KD2和KD3)的敲减效率分别为91.8%、84.2%和73.0%，KD1序列为最佳干扰序列，见图1。

Figure 1.The expression of beclin-1 at mRNA and protein levels in the SGC-7901 cells. A: the relative mRNA expression of beclin-1 detected by real-time PCR; B: the relative protein expression of beclin-1 determined by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.05vsNC group.

图1Beclin-1的mRNA和蛋白表达水平的变化

2 蛇六谷提取物抑制胃癌 SGC-7901细胞的活力

蛇六谷提取物处理胃癌SGC-7901细胞24 h，A值均低于对照组(P<0.05或P<0.01)，其中50和100 mg/L组的抑制作用显著，具有较好的线性关系，见图2A；50和100 mg/L蛇六谷提取物分别处理胃癌SGC-7901细胞5 d，随作用时间延长，A值逐渐减小，呈时间依赖关系(P<0.05或P<0.01)，见图2B。

3 敲减beclin-1基因表达对蛇六谷提取物抑制胃癌 SGC-7901细胞活力的影响

采用慢病毒作为转染载体，将beclin-1-RNAi转染胃癌 SGC-7901细胞。转染4 d， NC组和KD组的A值均低于CON组(P<0.01)；转染5 d， NC组和KD组的A值亦均低于CON组(P<0.01)。100 mg/L蛇六谷提取物处理KD组细胞(KD+TuAKe组)，随着作用时间延长，A值明显低于KD组(P<0.01)，呈时间依赖关系。100 mg/L蛇六谷提取物处理 NC组细胞(NC+TuAKe组)也可以看到同样的现象，随着作用时间延长，A值显著低于NC组，见图3。

Figure 2.The effects of TuAKe on the viability of SGC-7901 cells. The TuAKe was incubated with SGC-7901 cells for 24 h (A) and 5 d (B). Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

图2蛇六谷提取物抑制SGC-7901细胞的活力

Figure 3.The effect ofbeclin-1 silencing and TuAKe treatment on the viability of SGC-7901 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsCON group;##P<0.01vsNC group;▲▲P<0.01vsKD group.

图3沉默beclin-1基因和蛇六谷提取物对SGC-7901细胞活力的影响

4 敲减beclin-1基因表达对蛇六谷提取物促进胃癌 SGC-7901细胞凋亡的影响

100 mg/L TuAKe处理胃癌SGC-7901细胞和beclin-1基因沉默的细胞株， 2 d后流式细胞术检测细胞凋亡率。CON+TuAKe组、NC+TuAKe组和KD+TuAKe组细胞的凋亡率分别为13.00%±2.04%、13.58%±1.53%、23.53%±4.58%，分别高于CON组的8.20%±1.20%、NC组的7.40%±1.10%和KD组的16.40%±2.06%(P<0.05)，并且KD组细胞的凋亡率均高于CON组和NC组(P<0.01)，见图4。

5 RNAi法敲减beclin-1基因表达对SGC-7901胃癌细胞beclin-1和LC3蛋白表达的影响

CON+TuAKe组和NC+TuAKe组的beclin-1蛋白均高表达，分别高于CON组和NC组(P<0.01)，而KD组和KD+TuAKe组的beclin-1蛋白均未检出；CON+TuAKe组、NC+TuAKe组和KD组的LC3蛋白均高表达，分别高于CON组和NC组(P<0.01)，而KD+TuAKe组的LC3蛋白表达低于KD组(P<0.01)，见图5。

Figure 4.The effect ofbeclin-1 silencing and TuAKe treatment on the apoptosis of SGC-7901 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCON group;#P<0.05vsNC group;▲P<0.05vsKD group.

图4沉默beclin-1基因和蛇六谷提取物对SGC-7901细胞凋亡率的影响

讨 论

临床研究证明含蛇六谷的中药方剂在改善肿瘤患者常见症状、提高生存质量、降低复发转移和延长生存时间等方面均有较好的疗效。我们前期实验研究显示石油醚萃取的蛇六谷有效部位具有抑制胃癌细胞增殖的作用，进一步研究发现可能通过诱导自噬发挥抑制细胞增殖的作用，但其机制尚不清楚。

Beclin-1是自噬的重要调节蛋白，与抗凋亡蛋白Bcl-2相互作用，共同调控自噬[6-8]。前期研究表明蛇六谷提取物能够下调Bcl-2表达，促进胃癌细胞凋亡，抑制胃癌细胞增殖[3-4]。本课题重点研究beclin-1是否参与蛇六谷提取物抑制胃癌细胞活力。我们预实验检测了beclin-1的mRNA在SGC-7901、MKN-45和BGC-823等多个胃癌细胞的表达水平，结果显示beclin-1的mRNA在上述3种细胞均有表达，以SGC-7901细胞表达为最高。因此，本研究选用以SGC-7901细胞为靶细胞。

本实验结果显示，转染beclin-1-RNAi敲减SGC-7901细胞beclin-1的mRNA和蛋白表达，导致SGC-7901细胞活力下降和凋亡率增加,该结果与杨闯等[9]的报道基本一致，虽然靶细胞不同，但沉默beclin-1基因，靶细胞活力下降。我们推断，一方面beclin-1在各种细胞生理活动中发挥重要作用，维持细胞生长所必须[8,10]，沉默该基因势必影响细胞生长，甚至促进凋亡[8,10-11]；另一方面，beclin-1基因沉默导致细胞自噬信号通路受到抑制，可能阻碍了自噬体与溶酶体的融合，抑制自噬清除活性氧的能力[12]，造成线粒体膜电位不可逆损伤[11]，以及线粒体细胞色素C的释放[12]，降低细胞生长活力。采用蛇六谷提取物处理SGC-7901细胞，beclin-1基因敲减和未敲减的细胞活性均有降低，细胞凋亡率均有增加，并且beclin-1基因敲减的细胞活力明显低于未敲减的细胞，细胞凋亡率则明显高于未敲减的细胞，提示敲减beclin-1基因表达促进了蛇六谷提取物对SGC-7901细胞的抑制作用，在细胞活力和凋亡方面表现为协同作用。

Figure 5.The effect ofbeclin-1 silencing and TuAKe treatment on the protein expression of beclin-1 and LC3 in the SGC-7901 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsCON group;##P<0.01vsNC group;▲▲P<0.01vsKD group.

图5沉默beclin-1基因和蛇六谷提取物对SGC-7901细胞beclin-1和LC3蛋白表达水平的影响

TuAKe上调SGC-7901细胞LC3蛋白的表达，但并未上调beclin-1基因敲减细胞LC3蛋白的表达，表明沉默beclin-1基因能够部分阻断TuAKe诱发的自噬作用。Beclin-1沉默的SGC-7901细胞LC3蛋白表达上调，我们推断，beclin-1沉默促发生理条件下细胞自噬，促进LC3表达[8]；但是能够抑制诱生性自噬，下调LC3的表达[13-14]。沉默beclin-1基因有效抑制了SGC-7901细胞beclin-1的mRNA和蛋白表达，部分抑制了自噬通路的活化，但却加剧了蛇六谷提取物对该细胞的损伤作用，其机制仍不明确，需要进一步探讨。