外泌体在心力衰竭中的研究进展*

纪细心， 刘剑， 张文超， 陈硕， 周锐飞， 董一飞

南昌大学第二附属医院心血管内科(江西南昌 330006)

心力衰竭是泵功能和(或)充盈功能障碍引起体循环和(或)肺循环淤血的临床综合征，是高发生率、高致残、高病死率性疾病，随着人口老龄化，其数目在不断增长，全世界约有3 800万人患有心力衰竭[1]。因而洞悉心力衰竭发病机制为临床治疗提供良好的治疗方案亟待解决，传统机制包括交感神经异常激活、肾素-血管紧张素醛固酮系统、炎症氧化应激等。近年来随着医学的进步和发展，发现外泌体携带microRNA、mRNA、线粒体DNA(mtDNA)、蛋白质、脂质等多种活性物质，且参与多系统信息交流和信号转导产生生物学效应。外泌体在心血管疾病发生、发展过程中起重要作用[2-3]，而心力衰竭是多种心血管疾病的终末阶段，这激起人们研究外泌体在心力衰竭中作用的热情，为心力衰竭发病机制及治疗提供新的方向和指导。

1 外泌体基本生物学特征

1.1 外泌体形成、来源及其内容物 在20世纪80年代，Johnstone等[4]发现网织红细胞在成熟过程中分泌的小囊泡可以传递转铁蛋白，并首次将这种囊泡亚型命名为exosome(外泌体)。不同于微粒和凋亡小体(其他两种常见细胞外囊泡)直接由质膜脱落形成，外泌体是由细胞膜内出芽过程的开始而形成早期核内体，接着早期核内体再次内出芽形成各种管腔内囊泡，形成晚期核内体，包含腔内囊泡的晚期核内体称为多囊泡体，多囊泡体被运输到溶酶体进行降解，或者多囊泡体与细胞质膜融合从而将其内容物释放到胞外环境中，所释放的腔内囊泡为外泌体[5]。随后发现多种细胞(肿瘤细胞、淋巴细胞、树突状细胞、心肌细胞等)可以分泌外泌体，广泛存在于血液、尿液、胆汁、唾液等生物体液[6-8]，随循环在体内流动，被靶细胞摄取产生生物学效应，这不禁让人们对外泌体的内含物产生极大的兴趣。截止目前，发现外泌体已有9 769种蛋白质，3 408种mRNA，2 838种microRNA及1 116种脂类(http://www.exocarta.org/)，还有一些正在被发现中。普遍认为外泌体的标志蛋白包括热休克蛋白、四跨膜蛋白家族、多囊泡胞内体产生相关蛋白(Alix，Tsg101)、GTPaseRAB家族等[9]，这些成分多与外泌体的形成和起源有关。

1.2 外泌体发挥效应的机制 外泌体是机体细胞主动分泌的，无免疫原性，通过自分泌、旁分泌、远分泌方式发挥生物学效应[10-11]，与靶细胞作用方式如下：(1)配体(即外泌体)与靶细胞膜蛋白受体相结合进行信号转导；(2)外泌体与靶细胞膜融合，释放其内容物到靶细胞内发生效应作用；(3)外泌体被内吞影响靶细胞功能[12]。上述机制可能单一发生或者混合发生，细胞在不同应激状态，其机制可能会发生变化，这需进一步研究探讨，从而便于人们干预某个环节为临床服务。

2 外泌体与心力衰竭

基于外泌体的独特生物学特征，近年来发现外泌体参与心脏中细胞间的交流。除此之外，外泌体不仅体现心力衰竭的病理状态，而且存在于体液中可多次重复获取，使它成为心血管损伤的潜在标记物。另一方面外泌体参与心脏的病理性重塑，这为心力衰竭发病机制提供新的干预方向。

2.1 外泌体参与细胞间交流 心脏是由心肌细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞等构成网络维持心脏正常形态、结构及功能，这些细胞能分泌细胞因子促进彼此间交流。此外发现这些细胞能主动分泌外泌体参与心脏调节。心脏肥大常由压力负荷过重导致心脏结构变化，在肥大发生过程中，多种细胞通过外泌体携带microRNA及蛋白质向心肌细胞传递促肥大的信号分子。Bang等[13]表明心脏成纤维细胞来源的外泌体，携带“乘客”micro-21*(发现microRNA-21主要存在成纤维细胞中，micro-21*存在成纤维细胞分泌的外泌体中)，被心肌细胞摄取，靶向调节SORBS2和PDLIM5促进心肌细胞肥大。在动物实验中通过注射micro-21*抑制剂逆转了微泵注射血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导心脏肥大效应。另外AngⅡ预处理成纤维细胞，其分泌的外泌体携带高水平的肾素、血管紧张素原、血管紧张素1受体(AT1R)、血管紧张素2受体(AT2R)，被心肌细胞内吞，引起其血管紧张素转化酶2水平下调，产生和释放更多的AngⅡ，且上调AT1R、AT2R表达，导致心肌细胞肥大[14]。这都表明外泌体以旁分泌方式对心脏细胞间信息交流发挥重要作用。除此之外，小儿扩张型心肌病来源的血浆与人诱导多功能干细胞源性心肌细胞或初生大鼠心室肌细胞共孵育，发现扩张型心肌病来源的血浆影响心肌细胞B型利钠肽(BNP)基因的异常表达，研究证实该效应主要来源于血浆中外泌体，进一步研究发现该效应与外泌体数量关联不大，主要是其携带的内容物发挥的作用[15]。

外泌体同时参与内皮细胞调节。16 kD催乳素刺激内皮细胞使其主动分泌携带microRNA-146a的外泌体，以自分泌作用的方式促进内皮细胞凋亡，并抑制其增殖，导致围生期心肌病血管生成异常[16]。与其相反，心肌球细胞主动分泌携带microRNA-146a的外泌体促进心肌梗死后心脏血管生成和心脏功能的改善。因此，外泌体在不同病理条件下可能参与不同的信号通路调节，其具体机制需进一步研究[17]。高糖环境阻碍心脏血管生成。在大鼠2型糖尿病模型中分离的心肌细胞，与内皮细胞共孵育，发现其抑制内皮细胞增殖、迁移和管型形成的能力，研究发现这与病理状态下的心肌细胞分泌携带microRNA-320的外泌体有关[18]。

2.2 外泌体是心血管损伤的潜在标记物 心力衰竭是多种心血管疾病的失代偿阶段，发病率逐年上升，病死率居高不下。对心力衰竭患者而言，早期正确的诊治以延长患者生命、改善生存质量，而生物学标记物在心力衰竭的诊断和预后中发挥着重要的作用。常见生物学标记物包括BNP、半乳凝集素-3、肌钙蛋白等。虽然这些生物学标记物有一些优势，在心力衰竭患者危险分层和其他影响因素下仍存在明显局限性。比如BNP是慢性心力衰竭患者最常用的生物学标记物，用于诊断心力衰竭和判断其严重程度，但肥胖、慢性肾功能不全、肺脏疾病等影响其准确性，此外某些临床情况下BNP不能判断住院死亡率或者临床结局[19]。近年来发现外泌体在不同疾病状态下携带的物质发生改变，参与心室重塑和血管功能异常[20]。在黏液样退行性二尖瓣病变继发心力衰竭犬模型中，通过检测正常对照组、黏液性退行性二尖瓣膜病变组(MMVD)、黏液性退行性二尖瓣病变心力衰竭组(MMVD-CHF)血浆及血浆中外泌体，结果发现血浆中外泌体microRNA比血浆总microRNA更能体现疾病状态，而且不同阶段状态下外泌体携带的microRNA发生变化，比如正常对照组(micro-9、micro-495和micro-599)比较，MMVD(micro-9增加、micro-599下降)，MMVD-CHF(micro-181c、micro-495均增加)，因而更体现疾病状态下特异性[21]。此外，外泌体广泛存在于体液，稳定且易多次重复获取，这使外泌体有可能成为心力衰竭患者预后的一种潜在标志物。Matsumoto等[22]表明外泌体携带microRNA能预测急性心肌梗死后发生缺血性心肌病的风险。他们检测急性心肌梗死后1年内发生心力衰竭患者血浆中377种microRNA，发现P53调控性的microRNA-192、microRNA-194、microRNA-34水平明显升高，且富集在外泌体，并与患者急性心肌梗死1年后发生心力衰竭的风险密切相关，提示血浆外泌体变化或者联合其他生物标记物有可能帮助临床医护人员对心力衰竭进行早期干预，延缓疾病进展，改善患者生存质量。当然，对于外泌体作为心力衰竭标志物仍需大样本量、前瞻性的临床实验予以进一步证实。

2.3 外泌体参与心脏炎症和氧化应激调节 炎症在心力衰竭中扮演着不可忽视的作用。心力衰竭患者血浆和心脏的炎性细胞因子水平升高。很多研究表明慢性心力衰竭严重程度与血浆炎性细胞因子密切相关。近年来研究表明microRNA可调控炎症因子的表达。血浆中炎症因子、microRNA可以被包裹在外泌体中传递给靶细胞发挥效应。microRNA-146a是心肌高表达的microRNA，能在血浆或者外泌体中被检测到，参与细胞存活和免疫炎症调节[23]。Beg等[24]检测慢性心力衰竭患者和健康对照组的血浆总microRNA和血浆中外泌体microRNA变化，结果发现外泌体携带microRNA-146a比血浆总microRNA-146a与慢性心力衰竭关联更强。研究者在近期的一项研究中发现慢性心力衰竭患者血浆中炎性细胞因子(IL-1β和IL-8)水平明显升高，同时发现这些心力衰竭患者血浆中携带mtDNA的外泌体水平也更高[25]。为了进一步探讨其机制，在体外实验中，用心力衰竭患者的血浆外泌体刺激人外周血单核细胞(THP-1)，证实了THP-1细胞通过mtDNA/TLR-9/NF-κB信号通路诱导炎性细胞因子，这些升高的炎性细胞因子与外泌体携带的mtDNA拷贝数相关[25]。因此，调控富含mtDNA的外泌体可能为慢性心力衰竭患者提供靶向治疗。

氧化应激可引起大分子损伤和扰乱氧化还原信号通路，影响心脏结构和功能。核转录因子 Nrf2是细胞抗氧化应激体系中的关键转录因子，Nrf2 核转位并且结合核酸序列上的抗氧化反应元件ARE(即Nrf2-ARE信号通路)在细胞氧化应激损伤防护中发挥重要作用。最近研究表明外泌体携带microRNA-27a、-28-3p和-34a引起心脏Nrf2蛋白翻译异常，扰乱Nrf2-ARE信号通路，导致慢性心力衰竭的发展[26]。因此，调控富含以上microRNA的血浆外泌体可能是心力衰竭治疗中另一个潜在靶点[26]。

3 外泌体在心力衰竭治疗中的前景

3.1 干细胞源性外泌体 干细胞分化为新的心肌细胞改善心脏功能，是心脏再生学中的热点。干细胞移植增强左室射血分数、增加血管密度及改善心肌灌注的作用，越来越多的研究提示这些有益作用是干细胞旁分泌的活性物质发挥的生物效应。有研究利用急性心肌梗死动物模型，与未处理比较，间充质干细胞移植明显改善心肌梗死3 d后的心脏功能，且如此短期移植的间充质干细胞未分化为心肌细胞，这提示有其他机制参与心脏的修复[27]。在缺氧的环境下间充质干细胞可以旁分泌更多的活性物质，用其分泌的活性物质经冠脉注射来治疗缺血再灌住损伤的心脏，结果明显改善心脏功能、减少梗死面积[28]。此外Uemura[29]研究显示，缺氧预处理的骨髓干细胞治疗急性心肌梗死后缺血型心肌病，与正常含氧的骨髓干细胞比较，两者分化为心肌细胞的数目相似，但缺血预处理的骨髓干细胞明显改善心脏结构和功能(左室舒张和收缩末径减小、室壁增厚、梗死面积缩小、射血分数增强)。在体外实验中，与未处理的骨髓干细胞比较，缺血预处理的骨髓干细胞增强心肌细胞抗凋亡的能力，这效应主要来源于其分泌更多活性物质。进一步研究显示干细胞分泌的这些活性物质主要是外泌体[30-31]。在一项研究中，利用急性心肌梗死诱发慢性心力衰竭的动物模型，与对照组比较，人胚胎干细胞源性心血管祖细胞(human embryonic stemcell-derived cardiovascular progenitors，hESC-Pg)处理该动物模型6周后能显著减少左心室收缩末期容积、左心室舒张末期容积，减少梗死面积，提高左心室射血分数[32]。更有趣的是，发现来源于hESC-Pg的细胞外囊泡(主要是外泌体)处理上述动物模型能产生同等程度的心脏保护作用[32]。为了证实其发挥作用的成分，检测了hESC-Pg及其来源的细胞外囊泡(主要是外泌体)处理组的心脏基因芯片，与对照组比较，结果发现两者心脏有927个基因上调，上调的49个基因与心脏功能(或者心脏再生)相关，相关中的78%与增加细胞存活/增殖、DNA修复、减少纤维化改善心力衰竭相关信号通路相关。这在一定程度上表明外泌体携带其母细胞的特征，在治疗上安全有效，这无疑促进干细胞来源外泌体成为心力衰竭治疗的新药物。当然外泌体治疗研究仍局限在动物水平，其临床治疗仍在不断努力探索中。

3.2 缺血预处理源性外泌体 缺血预处理在心脏缺血再灌注损伤中发挥保护作用，而在慢性心力衰竭中的作用研究甚少。有研究显示，与对照组比较，慢性缺血性心力衰竭患者予以上臂缺血预处理(短暂缺血5 min继之再灌注5 min，进行4个循环，1次/d，持续4周左右)，并不能改善左心室收缩力，但可显著改善患者的骨骼肌功能，同时降低患者血压和血浆NT-proBNP水平[33]。Yamaguchi等[34]研究显示，双后肢缺血预处理急性心肌梗死后慢性心力衰竭大鼠模型(短暂缺血5 min继之再灌注5 min，1次/d，进行4个循环，持续4周)，发现较未处理组，心肌纤维化和血清氧化应激水平下降，同时缺血预处理组左心室收缩末期容积和舒张末期容积显著降低，舒张功能和射血分数显著改善。进一步发现双后肢缺血预处理大鼠可诱导骨骼肌分泌外泌体到循环，使血浆外泌体水平明显升高，外泌体携带microRNA-29a和胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)递送到心脏，最终改善心脏功能。

4 展望

自发现外泌体以来，关于外泌体的研究层出不穷，特别是近年来外泌体在心血管疾病中研究受到越来越多的关注。结合前述所知，外泌体参与心脏中的细胞交流，这让人们开始探索外泌体在心力衰竭发生发展中的作用。此外，与干细胞比较，外泌体有易保存、可重复获取且无免疫排斥等特点，因此在治疗中体现出更大的潜在优越性。另一方面，目前外泌体相关研究仍存在很多不完善的地方，比如外泌体的提取纯度、外泌体的半衰期、外泌体/人工包装修饰外泌体靶向性等问题。然而，尽管心血管相关外泌体的研究仍处于初级阶段，越来越多的研究已经表明外泌体在心力衰竭病理生理中扮演着极其重要的角色。