液态活检在肺癌研究中的进展

相绿竹，赵 琦，彭 瑞，王 晔 综述,牟晓峰△ 审校

(1.青岛大学医学部,山东青岛 266021；2.青岛市中心医院检验科,山东青岛 266042)

液态活检是指通过检测患者的血液、尿液、胸腹水、唾液、脑脊液等体液中的DNA、RNA、蛋白质来获取肿瘤相关信息的一类非侵入性病理检测方法。该技术最早出现于1974年SORRELS[1]利用关节腔内滑液诊断滑膜炎的研究中，如今已广泛应用于肿瘤的临床诊疗。相比于创伤性、单点取样的肿瘤组织活检，液态活检具有非侵入性、方便快捷、可多点多次多层面取样等优势，能够较好地克服肿瘤异质性，特别是在无法获取组织标本的情况下能够比较全面地反映肿瘤信息，在一定程度上弥补组织活检的不足。肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率极高，严重威胁着人类的健康[2]。本文从液态活检的研究内容、检测技术以及在肺癌的早期诊断、靶向治疗、动态监测和预后评估等方面的临床应用进行阐述，展现出液态活检在肺癌研究领域中的巨大潜力，为肺癌的临床诊疗提供新的手段与策略，加快精准医疗的发展。

1 液态活检的研究内容

1.1循环肿瘤细胞(CTC) CTC是指由肿瘤原发灶或转移灶脱落入血的肿瘤细胞，于1869年首次发现，半衰期约1.0～2.4 h，可单个存在或形成循环肿瘤微栓[3]。外周血中CTC水平很低，在已发生转移的肿瘤患者中每1×109个血细胞中大约有1个CTC，有研究发现每7.5 mL外周血中CTC< 2个的非小细胞肺癌(NSCLC)患者的总生存期为11.2个月，无进展生存期为6.2个月，而CTC≥2个的NSCLC患者的总生存期为8.3个月，无进展生存期为4.3个月，且NSCLC进展组的CTC数量高于对照组[4]，可以看出CTC数量可作为肺癌进展和预后不良的预测指标；一般认为CTC表面上皮细胞黏附分子(EpCAM)和细胞角蛋白(CK)阳性表达，白细胞特异度抗原CD45阴性表达，其恶性表型的细胞形态和携带的DNA、RNA和蛋白质等信息为研究者提供了从细胞层面和亚细胞层面分析肿瘤细胞的机会，而且CTC具有干细胞特性，能够发生上皮间质转化，促进细胞的迁移、侵袭和耐药性的形成[5]；此外，体外培养分离的CTC可以构建CTC细胞系和CTC的异种移植物模型(CDXs模型)，HODGKINSON等[6]发现由小细胞肺癌(SCLC)患者的CTC构建的CDXs对化疗的反应与患者对化疗的反应相似，这对于药物的筛选和促进个体化治疗具有重要意义。

1.2循环肿瘤DNA(ctDNA) 前人研究发现，肿瘤患者外周血中循环游离DNA(cfDNA)水平明显高于非肿瘤患者，且cfDNA携带癌基因/抑癌基因突变、拷贝数差异、融合基因、微卫星不稳定、甲基化状态等肿瘤相关信息。进一步研究后把来自原位肿瘤、转移灶中凋亡与坏死的细胞或者CTC中释放的携带肿瘤相关信息的游离DNA称为ctDNA[7]。一般来说，ctDNA的相对分子质量比cfDNA低，且以碎片化呈现，半衰期16.0 min至2.5 h，具有潜在的致瘤性[8]；ctDNA的水平高于CTC且较容易获得，其携带的基因突变信息为肺癌患者的靶向治疗提供了依据，美国食品和药品管理局2016年批准ctDNA可用于检测NSCLC患者是否存在表皮生长因子受体(EGFR)突变，以指导NSCLC患者靶向用药；有研究发现，NSCLC患者的血清cfDNA水平显著高于健康对照组，且其水平与NSCLC分期相关，同时也发现与影像学相比，cfDNA水平变化可提前1～7个月监测到NSCLC患者的疾病进展[9]。

1.3外泌体 外泌体是由内皮细胞、血细胞、免疫细胞、肿瘤细胞等多种细胞分泌的直径为40～100 nm、密度为1.13～1.19 g/m的一种胞外囊泡，表面有CD9、CD63、CD81等特异性标志物，在血液、尿液、胸腹水等体液中均存在；肿瘤细胞来源的外泌体具有促进肿瘤微环境的形成，增加细胞转移与侵袭能力，介导肿瘤免疫抑制等作用[10]；其富含DNA片段、信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)和蛋白质等物质，能反映来源细胞的生物学特性，研究发现外泌体所携带的miR-21和miR-4257的表达上调与NSCLC的复发有关，其表达水平与患者的生存期呈负相关[11]，这对肺癌的进展和患者的预后具有潜在的提示作用。

1.4其他液态活检研究内容 循环肿瘤RNA(ctRNA)：1996年首次在黑色素瘤患者的血液中被发现，后续在多种肿瘤患者的外周血中发现存在mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA等ctRNA。与ctDNA不同的是，ctRNA所携带的信息可以反映肿瘤患者转录水平、表观遗传水平以及其他机制引起的基因表达谱的改变[12]。因此，ctRNA的分析在肿瘤研究中具有巨大的潜在价值。

肿瘤化血小板(TEPs)：肿瘤细胞将肿瘤相关分子转移至血小板，使其RNA和蛋白质发生改变，成为TEPs。TEPs被认为是机体对肿瘤的一种反应，其水平丰富、易分离获得，可促进肿瘤的生长与播散，但具体机制尚未明确[13]。有研究者用迭代算法和“swarm-intelligence”对NSCLC患者TEPs RNA进行分析，发现TEPs诊断Ⅰ～Ⅲ期 NSCLC(>100个样本)的准确度为81%，诊断晚期NSCLC(> 500个样本)的准确率为89%[14]，这提示TEPs RNA在肺癌的辅助诊断方面的价值不容忽视。

肿瘤内皮细胞(TECs)：不存在于正常组织中，其形态多样、排列无序，可通过分泌一种称为biglycan的蛋白与肿瘤细胞相互作用，促进肿瘤的转移播散[15]。目前仍处于研究阶段，还需要大量的临床验证。

2 液态活检的相关技术

2.1液态活检的捕获技术

CTC的富集：目前CTC的富集方法有基于肿瘤细胞大小的膜过滤法、基于细胞密度的密度梯度离心法、基于EpCAM+CK+CD45-等表面标志物的捕获法(Cellsearch、微流控技术、多肽纳米磁珠法)和差相富集技术[2]。当然还有基于3D纳米基质、分层纳米线芯片等富集方法，对CTC的富集效果也不错[16]。

ctDNA与ctRNA的提取：临床研究中ctDNA与ctRNA的提取有商品化试剂盒，如Qiagen DNA提取试剂盒、SPLIT RNA提取试剂盒等，操作简便、应用广泛。

外泌体的分离：除了密度梯度超速离心和免疫磁珠捕获的方法提取外泌体外，超滤离心法和ExoQuick试剂盒能够更加快速有效地提取外泌体。有研究者开发了一种基于新型声波流体技术的声波筛选装置：用一个微流体通道去除血液样本中的细胞和血小板，接着在声波频率较高的装置内把外泌体与较大的胞外囊泡分开，这种方法同样可以有效地提取外泌体[17]。

TEPs的富集：血小板水平丰富、分离简单且有标准的操作程序，多次密度梯度离心去除血细胞即可收集血小板，期间要注意血小板的活性和防止血小板凝集[13]。

2.2液态活检的检测技术

2.2.1ARMS-PCR ARMS-PCR是根据已知突变位点设计引物，当患者基因片段存在突变时，该片段会被扩增，同时阻滞野生型基因片段的扩增反应。该方法适用于检测已知突变位点，方便快捷、灵敏度高、特异度高且应用广泛，此技术已被批准用于检测晚期NSCLC的EGFR突变，也是血液EGFR突变检测专家共识推荐的技术。ARMS-PCR的升级技术--Super-ARMS的灵敏度可达0.2%，更加有利于已知突变位点的检出[18]。

2.2.2数字PCR 区别于普通PCR的相对定量，dPCR是对DNA分子的绝对定量。dPCR技术主要包括微滴数字PCR(ddPCR)、BEAMing技术以及QuantStudio 3D dPCR。ddPCR是将含有核酸分子的反应体系分成上万个纳升级的微滴，其中每个微滴不含或含一个待检核酸靶分子，经过PCR扩增后进行统计分析即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度[18]；BEAMing技术结合了dPCR以及流式技术，每一种DNA分子都会与专一的磁珠相连接并扩增，然后DNA分子之间的差异通过流式细胞仪检测；基于芯片技术的QuantStudio 3D dPCR可对RNA进行绝对定量[19]。dPCR的灵敏度可达0.1%～0.0001%，实现了分子的绝对定量，准确度高且易于掌握，在动态分析个体突变、检测稀有突变、量化特定的核酸种类等方面具有重要价值。

2.2.3NGS NGS是将待测基因打断成若干DNA片段，然后两端加上接头，进行扩增的同时检测信号的高通量测序技术，此技术大体分为建库、高通量平行测序和生物信息学分析3大部分。NGS可同时对数百万个DNA分子进行测序，随后进行比对，检测已知或未知的基因变异，具有高通量、灵敏度高、可发现新的未知突变位点等优势。随着技术的发展，基于NGS及PCR技术的标记扩增深度测序、癌症个体化深度测序分析，不仅可以检测点突变、插入、缺失或重排，还可以检测拷贝数变异和基因融合[20]。

3 液态活检在肺癌中的临床应用

3.1早期筛查与辅助诊断 ILIE等[21]发现对于肺癌的高风险人群来说，可在CT扫描未检测到结节前，通过对CTC的细胞形态学鉴定和检测其上皮-间充质标志物的表达，可以提前预测肺癌的发生；同时还发现在这些高风险患者中检测到的CTC的表型与其组织肿瘤表型相似。由此可见，CTC在肺癌的早期筛查中扮演了一定的角色。PHALLEN等[22]利用靶向错误校正测序(TEC-Seq)的方法对44例健康个体和200例肺癌、结直肠癌、乳腺癌以及卵巢癌患者的cfDNA进行分析评估，分别检测到Ⅰ期或Ⅱ期患者的血浆中的体细胞突变的概率为59%、71%、59%、68%，而且术前较高水平的cfDNA与肿瘤的复发相关；同时研究发现基于ctDNA的超深度测序分析NSCLC的6个不同基因中的568个突变，灵敏度和分析特异度分别为90.5%和100.0%，这为辅助临床诊断提供了有力的支持。

3.2指导临床靶向用药 利用液态活检技术对肿瘤基因组进行分析，结合患者具体情况，可指导临床用药。在无法进行组织活检的情况下，HU等[23]通过分析225例晚期NSCLC患者的CTC中EGFR突变情况以指导临床用药；也有研究表明可以利用CTC中间变性淋巴瘤激酶(ALK)基因重排情况来指导克唑替尼的使用，以促进个体化治疗[24]；研究者同时检测组织DNA和ctDNA中的EGFR突变情况发现两者具有很高的一致性，基于ctDNA检测的EGFR突变情况可以指导晚期NSCLC患者采用表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)治疗[25]。在对外泌体的研究过程中发现可以利用外泌体DNA进行EGFR分子分型和EGFR T790M分析，其结果与组织分子分型的结果具有很高的一致性，而且联合检测外泌体中的DNA/RNA和ctDNA可以提高检测EGFR的灵敏度和特异度，为患者选择正确的靶向药物提供强有力的依据[26]。除此之外，关于TEPs的研究发现凭借RNA测序分析肿瘤(NSCLC、胰腺癌、乳腺癌等)患者血小板信息，鉴别出癌症亚型的正确率为71%，且能够正确识别突变基因EGFR、KRAS、PIK3CA，对临床用药具有指导意义[27]。

3.3实时监测药物疗效 实时动态监测患者体内肿瘤状态，能够准确把握疾病的发展状况，提高治疗效果，延长肺癌患者的生存期，改善生活质量。有研究者对EGFR-TKI继发耐药患者的CTC进行分析，发现约有80%的患者能够检出与组织活检相同的T790M突变[28]；同样对使用EGFR-TKI药物的NSCLC患者的ctDNA进行检测，有47%(55/117)的患者发生了EGFR T790M突变，结果提示临床及时调整用药，以延长患者总生存期[29]；而且NEWMAN等[30]对NSCLC患者ctDNA的分子特征进行分析，发现存在插入、缺失、点突变以及ALK重排等改变，并证明与影像学相比，ctDNA的分析可以更好地评估患者早期对治疗的反应，并可用于区分残留病变和治疗相关改变。最近的一项研究利用等位基因特异性PCR的方法分析NSCLC患者的外泌体RNA/DNA中的EGFR T790M突变，灵敏度为92%，特异度为89%，可见外泌体在耐药性分析方面的潜力巨大[31]。除此之外，关于TEPs的研究表明TEP具有实时动态监测的潜力，可以比影像学检查更早地提示疾病的进展[13]。

3.4预后评估分析 CTC和ctDNA代表的肿瘤分子信息以及它们的水平变化在一定程度上可以反映患者的无进展生存期[32]；此外，在对外泌体的分析中发现miR-23b-3p、miR-10b-5p、miR-21-5p的表达上调预示着NSCLC患者有更差的预后[33]；同样在对接受克唑替尼药物治疗的肺癌患者的血小板进行RNA分析时，检测出EML-ALK+的患者无进展生存期为3.4个月，EML-ALK-的患者无进展生存期为16个月[34]。

4 小 结

液态活检凭借其非侵入性、能较好地克服肿瘤异质性、可动态监测肿瘤信息等优势，尤其是在无法获取组织标本的情况下，为肺癌的早筛、诊断和治疗开辟了新道路。尽管目前还存在一些问题，如灵敏度与特异度更高的分离检测方法仍需要临床验证以推进液态活检在肺癌诊疗中的应用，尚未建立标准统一的样本采集、处理、分析程序，从研究到临床转化还需更充分的证据支持，但它在肺癌诊疗中的潜力是不可忽视的[35]。通过更先进的分子生物学检测方法来增强其可信度和可实践性，液体活检将会获得重大的进展并广泛应用于临床实践。未来液体活检技术必将在肺癌的早期诊断、靶向用药、动态监测、预后评价等方面发挥更大价值。