基于共价接枝的钛种植体载药抗菌涂层的研究进展

刘育豪 袁泉 张士文

口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院种植科 成都 610041

牙科钛种植体的10年成功率已达90%以上，已广泛用于牙列缺损或缺失患者的修复[1]。然而，植入区骨质条件差、患有糖尿病等基础疾病、种植体周围发生感染等因素仍是种植体长期存留的隐患[2]。有研究显示，术后5年的种植体周围感染（peri-implant infection）发生比例可达14%[1]。感染早期表现为种植体周围黏膜炎，仅累及种植体周围的软组织，而晚期表现为种植体周围炎，除造成种植体周围软组织炎症外，还伴有种植体周围支持骨的吸收，甚至还会导致种植体松动及脱落[3-4]。因此，减少种植体周围感染的发生已成为口腔种植学领域的热点及难点。

另一方面，过去对种植体改性的研究集中于通过优化种植体表面的形貌、化学成分、亲水性等性能，进而促进其骨结合能力[5]。例如，有研究[6]证实多孔表面（微米级或纳米级）更利于建立骨结合。近来的研究[7-8]指出，表面粗糙度的增加也会促进细菌的黏附和增殖，更容易形成菌斑生物膜，不利于减少种植体周围感染的发生。因此，以提高抗菌性能为宗旨的表面改性已成为新的研究方向，例如调控表面粗糙度或亲水性以抑制细菌黏附[9]，构建有抗菌性的聚合物涂层（如壳聚糖涂层）以及构建载药涂层。载药涂层可释放药物至种植体周围区域以实现主动且强效的抗菌作用，对于减少周围感染的发生极具前景[10]。

图1 物理混合载药涂层

图2 共价接枝载药涂层Fig 2 Covalent grafting drug-loaded coatings

构建载药种植体的难点在于如何实现药物与种植体表面的结合，结合方式对药物的释放效率及抗菌性能有重要影响。过去的研究主要集中于将抗菌药物通过物理混合的方式直接载入各类表面涂层材料，包括羟磷灰石涂层[11]、二氧化钛纳米管[12]、聚合物涂层[13-14]等。药物通过物理吸附的方式存留于涂层孔隙中，扩散至种植体周围区域发挥抗菌作用（图1）。然而，基于物理吸附的载药种植体的显著缺点是其药物释放呈现为最初的短期“爆发式释放”及后续的缓慢少量释放[15]，难以实现感染的长期预防，而且容易产生细菌耐药性。因此，共价接枝法（covalent grafting）逐渐受到学者关注（图2）。共价固定的药物可长期存留于种植体表面，在局部持续发挥较强的抗菌作用，是极具前景的载药方式。

1 共价接枝载药抗菌涂层的构建

共价接枝指的是药物分子直接通过共价键固定于材料表面，或者通过接枝分子间接共价固定于材料表面。对于后者，接枝分子的一端与材料表面形成共价键，而另一端与药物分子的特定基团形成共价键，在确保共价接枝稳定性的同时，可提高药物分子的移动性，以提高抗菌性能，因此成为主要接枝方式。

1.1 抗菌药物

早在十余年前已有研究将抗生素用作种植体抗菌涂层，取得良好抗菌效果。例如Edupuganti等[16]通过双乙二醇将万古霉素共价固定于钛表面，在生理缓冲液中保存44 d后仍未观察到金黄色葡萄球菌定植。因抗生素抗菌机制确凿，且多类抗生素各具优异性能，例如杆菌肽[17]可同时抑制革兰阳性菌并促进干细胞成骨分化，多西环素[18]对牙周病及种植体周围炎有特异性抗菌作用，近年来仍不断有研究将各类抗生素用于种植体抗菌涂层。然而，随着抗生素的滥用，细菌的耐药性已成为全球医疗界的棘手难题，非抗生素类药物已受到学界越来越多的关注（表1[19-27]）。

银离子是一种高效的广谱杀菌剂，在极低浓度下即有抗菌或杀菌作用，同时对人体正常细胞没有或仅有微弱的毒性。其抗菌机制主要包括破坏细胞壁和细胞膜进而引起破裂穿孔，以及破坏细胞内蛋白质和核酸。已有较多研究将银离子引入种植体抗菌涂层，但其浓度选择以及长期毒性仍有待进一步的确定。

1.2 接枝分子

多种接枝分子（例如聚乙二醇[20]、硅烷偶联剂[28-29]、磷酸自组装单分子层[22]、多巴胺/聚多巴 胺[30]等）已被学者用于构建种植体载药涂层。

表1 共价接枝载药抗菌涂层采用的非抗生素类药物Tab 1 Non-antibiotics used in covalently grafted antimicrobial coatings

目前，在接枝分子的选择上，需重点考虑其构建载药涂层的便捷度与灵活性。多巴胺/聚多巴胺涂层近年来在生物材料表面修饰领域内受到大量关注。将钛浸于多巴胺单体溶液即可获得结合牢固的聚多巴胺涂层，相比于其他分子的共价接枝，该制备过程兼具简易与高效的优势[31]。此外，聚多巴胺分子中含有多种官能团，使其可与多类基团以不同类型共价键结合，大大提高了结合药物的灵活性。

另一重点考虑的因素是，接枝分子的结构性质对于载药涂层的抗菌性能有显著影响。例如Nie等[20]通过聚乙二醇将KR-12多肽（抗菌肽LL-37的衍生物）共价固定于钛表面，与通过硅烷偶联剂将KR-12多肽共价固定进行比较。结果显示，前者能够更为显著地降低表皮葡萄球菌的黏附与生物膜形成。研究者认为聚乙二醇具有更长的分子链，增强了KR-12多肽的移动性，更有利于接触并杀灭细菌。类似地，Godoy-Gallardo等[19]通过表面引发原子转移自由基聚合技术在钛表面引入接枝分子链，其与抗菌肽hLf1-11共价连接。与通过硅烷偶联剂共价固定相比，该载药涂层对血链球菌和唾液乳杆菌的黏附具有更强的抑制作用。该接枝分子除具有更长的分子链外，其显著优势为整条分子链上可连续密集排列抗菌肽hLf1-11，而非仅在分子链末端连接，因此显著提高了局部药物浓度，进而提高了抗菌性能（图2）。

2 共价接枝载药抗菌涂层的应用优势

2.1 优化药物释放模式

通过物理吸附法将药物固定于羟磷灰石等种植体表面涂层内，药物释放通常呈现为初期的数小时“爆发式释放”及后续的数天少量释放。高浓度药物对人体正常细胞有潜在的毒性作用[15]，而低浓度药物则可能引起耐药性[32]。通过共价接枝将药物固定于种植体表面，可明显限制其释放速率，使其在至少数周内维持局部高抑菌浓度[16,33]，以实现较强的抗菌作用。此外，因仅有抑菌浓度的药物持续释放，对周围的人体正常组织的毒性作用较小[34]。

2.2 改变药物的抗菌机制

共价接枝不仅通过维持局部高抑菌浓度来提高抗菌作用，同时也可能赋予抗菌物质新的抗菌机制。以抗菌肽为例，破坏细胞膜及细胞内杀菌是游离抗菌肽的主要抗菌机制。Gao等[35]通过亲水性接枝分子将抗菌肽共价固定于钛表面，体外及体内实验证实该载药涂层有显著的抗菌作用。该实验中的抗菌肽由12个氨基酸组成，其长度最多为5.5 nm，而革兰阴性细菌的细胞膜厚度为20～80 nm，因此几乎不可能进入细菌细胞质。研究者推测，共价固定造成了局部高浓度正电荷，基于静电相互作用（electrostatic interaction）而非穿胞裂解，干扰了细菌带负电荷的细胞膜，最终造成细菌自溶/死亡。游离抗菌肽的穿胞作用与细菌细胞膜蛋白质等结构密切相关，因而细菌可能发生细胞膜蛋白质构象改变等变异，导致耐药性的产生[36]。大部分细菌表面带负电荷，且细菌难以在携带电荷的性质上发生改变，因此基于静电相互作用的抗菌机制很可能更利于减少耐药性的产生。此外，共价固定的银化合物也可能存在类似的抗菌机制转变。

2.3 提高药物稳定性

Holmberg等[21]用硅烷偶联剂将抗菌肽GL13K共价固定于钛表面，与共价固定非抗菌性多肽的钛表面相比，前者对牙龈卟啉单胞菌有更强的抑制作用。牙龈卟啉单胞菌是引起种植体周围炎的重要细菌，可溶性抗菌肽GL13K对部分牙龈卟啉单胞菌菌株的抗菌作用不显著，因为这些菌株分泌的牙龈菌蛋白酶（gingipain）可破坏其活性[37]。研究者推测，虽然牙龈卟啉单胞菌分泌的牙龈菌蛋白酶游离于周围液体环境中，但该实验中抗菌肽GL13K接枝于钛表面，受共价键限制而无法游离至周围环境中，在很大程度上避免了与蛋白酶接触，因而抗降解能力显著提升，可发挥可溶性抗菌肽GL13K不具备的抗菌作用。

3 共价接枝载药抗菌涂层的不足

相对于传统载药方式，现阶段的共价接枝技术也有不足之处。首先，因共价接枝法需将药物分子严格地以共价键连接到钛表面，常涉及较为繁琐或苛刻的化学反应步骤，不仅有试剂残留的可能性，而且构建流程耗时且昂贵，难以投入实际生产[38]。因此应重视简化共价接枝涂层的制备过程，以及严格检测各类化学试剂的表面含量。其次，当共价接枝多肽/蛋白质类药物时，药物分子的部分基团参与共价键的形成后可能引起局部或整体的分子构象改变，使得发挥抗菌作用的相关位点难以暴露于分子表面或难以呈现最佳的排列方式，最终降低抗菌活性[34]。后续研究应对这一现象深入印证并探讨改善策略。此外，因目前相关研究主要处于体外实验阶段，共价接枝载药抗菌涂层在体内环境中的抗菌作用是否会受某些因素影响，以及是否会产生目前未知的不良反应，仍待观察与探索。

4 共价接枝载药抗菌涂层的发展方向

4.1 继续优化药物释放模式

共价固定的药物发挥抗菌作用主要依赖于局部作用而非药物释放。最近有学者[32,39]提出一种新颖的“智能释放”（smart release）模式，其设想为药物载体可感受周围环境的变化，在合适的时机释放药物。对于共价接枝构建载药抗菌涂层而言，可设计特定的接枝分子，没有细菌侵入时其与药物分子保持稳定连接，维持局部高药物浓度；而当引起种植体周围感染的相关细菌（例如牙龈卟啉单胞菌）侵入时，接枝分子的特定结构可被细菌分泌的特异性蛋白酶降解，引起药物迅速释放而有效杀灭周围细菌，阻止感染发生。

4.2 建立抗菌性能的评价模型

当前的研究对于载药种植体抗菌性能的评价主要通过体外实验进行，如测定细菌在材料表面的黏附、增殖情况，较少有研究使用动物模型评价抗菌性能[40]。目前尚缺少能同时评价材料成骨性能和抗菌性能的标准化方法[7,41]。建立能够同时模拟成骨微环境及感染发展过程的动物模型，对于全面评价载药抗菌涂层性能有重要意义。

4.3 改善抗菌涂层的成骨性能

虽然共价固定的抗菌药物被局限于种植体表面区域，与周围的人体正常组织相互作用较小，仍有学者认为需提高其成骨性能，以弥补潜在的不良反应。有研究[17]转而采用既有促进成骨性能又有抗菌活性的药物，例如杆菌肽。也有研究[42-43]将RGD多肽与抗菌肽同时共价固定于钛表面。因RGD多肽有良好的骨相容性，与抗菌肽以适宜比例共存于钛表面时，可兼顾钛种植体的骨整合性能与抗菌性能。

综上所述，基于共价接枝的钛种植体载药抗菌涂层发展迅速且前景良好，其特征为将药物共价固定于种植体表面以实现局部长期作用，与其他载药方式相比具有优化药物释放模式、改变药物抗菌机制、提高药物稳定性等优点。后续研究应进一步改良共价接枝载药涂层的综合性能，且深入开展动物实验以探究材料在体内环境中的生物学效应，以期切实提高其应用价值，并尽早转化至临床应用。