与牙周炎相关的组织蛋白酶研究进展

聂然 郭天奇 李雪 裴婷婷 秦勤 周延民

吉林大学口腔医院种植中心 长春 130021

组织蛋白酶（cathepsin）最早于1929年由Willstätte和Bamann首次发现并命名，是一种广泛存在于溶酶体中的蛋白质水解酶，具有维持细胞内动态平衡的作用。目前在人体内发现的组织蛋白酶共有15种，包括2种丝氨酸蛋白酶（组织蛋白酶A、G）、11种半胱氨酸蛋白酶（组织蛋白酶B、C、F、H、K、L、V、O、S、W、Z）以及2种天冬氨酸蛋白酶（组织蛋白酶D、E）。组织蛋白酶除了可以降解蛋白质，还可以通过水解作用活化细胞内某些蛋白质的前体，或激活其他蛋白质水解酶系统，从而参与抗原加工、骨基质降解、细胞凋亡、神经系统发育等生理活动[1]。

组织蛋白酶在细胞外的异常表达与肿瘤、心脑血管疾病、骨质疏松症、类风湿性关节炎、牙周炎等大量病理状态密切相关[1]。牙周炎是成人牙齿丧失的首要原因，其造成牙周支持组织的破坏与多种组织蛋白酶相关。本文就与牙周炎致病相关的组织蛋白酶K、B、C、G进行综述。

1 组织蛋白酶

1.1 组织蛋白酶K

组织蛋白酶K是溶酶体半胱氨酸蛋白酶家族的成员，是一种属于C1A家族的番木瓜蛋白酶，为肽链内切酶。组织蛋白酶K由染色体1q21上大约12.1 kb的基因组编码，具有8个外显子和7个内含子。组织蛋白酶K是由329个氨基酸构成的多肽序列，包含15个氨基酸构成的N-末端，99个氨基酸构成的前肽和215个氨基酸构成的催化单元。

组织蛋白酶K存在带高度正电荷的碱性残基，可引起带负电荷的糖胺聚糖（glycosaminoglycan）进行变构调节，形成组织蛋白酶K和糖胺聚糖的高分子低聚复合物，这是组织蛋白酶K具有独特的胶原降解活性的基础，其胶原酶活性高度依赖于复合物中糖胺聚糖的性质和浓度[2]。

组织蛋白酶K是除基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）外，能够在中性pH条件下完全降解三螺旋胶原结构的少数蛋白酶之一，还可以水解明胶、弹性蛋白和骨粘连蛋白[3]。

众所周知，Ⅰ型胶原是构成骨基质的主要有机成分，因此组织蛋白酶K与类风湿性关节炎、骨关节炎、牙周炎等骨代谢疾病密切相关。组织蛋白酶K最初被认为仅在破骨细胞中特异性表达，然而近年来研究发现，组织蛋白酶K的表达广泛存在于人体的细胞、组织及器官中。

牙周炎的发生、发展涉及一系列免疫炎症反应，进而出现牙龈炎症出血、牙槽骨吸收、牙松动脱落等表现。其中，破骨细胞、免疫细胞（T细胞、巨噬细胞等）、细胞因子等在该病理过程中发挥重要作用。组织蛋白酶K在牙周炎中的破骨作用已被公认，而其在免疫反应中的作用也得到初步探究。

组织蛋白酶K是破骨细胞的主要标志物之一，在活化的破骨细胞中高度表达，通过降解骨基质中的Ⅰ型胶原调节骨吸收[4]。在病理状态下，组织蛋白酶K活性增强，骨吸收大于骨形成，导致了牙槽骨基质的降解。核因子-κB受体活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）-核因子-κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）信号通路作为骨代谢的关键通路，使成骨细胞和破骨细胞发生偶联。其中RANK与核因子（nuclear factor，NF）-κB、活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T cell，NFAT）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）等下游信号通路结合，可调控破骨细胞的激活。Mogi等[5]发现，牙周炎患者龈沟液中组织蛋白酶K的浓度高于健康者，并且组织蛋白酶K与RANKL水平呈正相关，认为RANKL的过量表达导致破骨细胞活化和组织蛋白酶K产生，诱导了牙周疾病破骨性骨吸收。Li等[6]研究表明，组织蛋白酶K启动子中存在NF-κB的结合位点，认为NF-κB途径是介导破骨细胞表达组织蛋白酶K的关键通路。Balkan等[7]的研究表明，组织蛋白酶K转录起始点上方存在NFAT结合位点，由此NFAT可对组织蛋白酶K的表达起调控作用。Kamolmatyakul等[8]认为，白细胞介素（interleukin，IL）-1α可通过NF-κB途径激活破骨细胞中组织蛋白酶K的过度表达，引起牙周炎等骨吸收疾病。

综上，根据经典的RANK-RANKL信号通路，组织蛋白酶K引起牙周炎牙槽骨吸收的机制为：在生理条件下，成骨细胞产生的RANKL与破骨细胞前体表面的RANK相结合，诱导肿瘤坏死因子受体相关因子（tumor necrosis factor receptorassociated factor，TRAF）募集与激活，从而激活多重信号通路（如NF-κB、NFAT）级联反应，诱导破骨细胞分化[9]；在局部炎症等病理条件下，促炎因子（如IL-1α等）可刺激RANKL的表达增加[10]，进而通过NF-κB途径、NFAT途径等激活组织蛋白酶K的过度表达，从而引起骨基质降解。

近年来发现，组织蛋白酶K除了在破骨过程中发挥重要作用外，也参与了牙周炎的免疫炎症反应过程。Hao等[11-12]通过将组织蛋白酶K特异性抑制剂作用于牙周炎模型小鼠上，得出应用抑制剂可减少牙周炎损伤区破骨细胞、巨噬细胞、T细胞的数量，以及抑制牙周炎牙龈上皮细胞中Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）4、5、9及炎性细胞因子的表达，提示组织蛋白酶K抑制剂的应用可减少牙周炎进程中的骨丧失和免疫炎症反应，减缓牙周组织病变。通过对比类风湿性关节炎和牙周炎小鼠病理过程，证明组织蛋白酶K介导的两种疾病免疫应答机制相似。Chen等[13]研究发现，组织蛋白酶K基因沉默的小鼠不仅可以减少破骨细胞产生的骨吸收，还能通过改变炎性细胞因子的表达及T细胞和树突状细胞的数量，大大减少牙周组织炎症。由此看来，组织蛋白酶K参与牙周炎的免疫反应初步得到证实，但具体机制还需进一步研究。

1.2 组织蛋白酶B

组织蛋白酶B是溶酶体半胱氨酸蛋白酶家族中第一个被确定结构的酶。组织蛋白酶B与组织蛋白酶K同属于番木瓜C1A家族。编码组织蛋白酶B的基因大约27 kb，由13个外显子（包括在外显子2和3之间新发现的2a/2b）和11个内含子组成，位于染色体8q22[14]。组织蛋白酶B是由339个氨基酸构成的酶原转变而来。

组织蛋白酶B是少见的同时具有肽链内切酶和肽链外切酶活性的蛋白酶，其多酶活性得益于独特的“闭合环”结构。在溶酶体的酸性条件下，“闭合环”在酶活性位点闭合，表现为肽链外切酶；在中性条件下，“闭合环”开放，表现为肽链内切酶；在碱性条件下，组织蛋白酶B失活[15-16]。正是由于其具有双重蛋白质水解活性，可直接或间接参与多种细胞外基质（如多型胶原和弹性蛋白）的降解。在生理状态下，组织蛋白酶B在体内的表达在多层次水平上被严格调控；在病理状态下，调节发生改变，溶酶体膜稳定性下降，过量表达的组织蛋白酶B会介导细胞炎症性坏死和细胞凋亡[17]。研究发现组织蛋白酶B与恶性肿瘤、胰腺炎、牙周炎、阿尔兹海默症等疾病中细胞的大量坏死和凋亡关系密切。

尽管组织蛋白酶B在牙周炎发生、发展中的具体机制尚未完全阐明，但众多研究结果显示，组织蛋白酶B与牙周炎的发生、发展有密切关系。成纤维细胞广泛存在于牙周结缔组织中，通过产生胶原在组织修复中发挥重要作用。

Cox等[18]发现，在体外培养的慢性牙周炎患者的成纤维细胞中，组织蛋白酶B高水平表达。Li等[19]发现，慢性牙周炎患者牙龈组织中TLR2和组织蛋白酶B高度表达，与Kennett等[20]发现组织蛋白酶B在炎性牙龈组织高表达相一致。Li等[19]用牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）脂多糖（lipopoly-saccharide，LPS）刺激成纤维细胞，作用3、12 h组织蛋白酶B表达无组织学差异；作用24、48 h组织蛋白酶B的表达显著升高，NF-κB抑制蛋白α（inhibitor of nuclear factor-κB α，IκBα）逐渐下降，Ⅲ型、Ⅳ型胶原显著降低。作者认为可能的机制为，组织蛋白酶B在细菌感染的急性和中期阶段未增加，而是通过慢性活化TLR2/NF-κB通路，调节成纤维细胞中胶原表达。LPS是TLR4和TLR2的有效配体[21]，TLR2识别牙龈卟啉单胞菌的LPS后，可通过系列反应使IκBα发生磷酸化后被组织蛋白酶B降解，从而慢性活化NF-κB通路，降解Ⅲ型和Ⅳ型胶原[19,22]。Ⅲ型胶原是构成牙周结缔组织的第二大组成部分，因此认为组织蛋白酶B可以通过此机制和通路造成牙周组织的损伤。然而，李倩等[23]通过唾液蛋白酶谱检测分析发现，慢性牙周炎患者的组织蛋白酶B表达较牙周健康者低。

由此看来，组织蛋白酶B在体内的调节是一个复杂的过程，具体调节机制尚不明晰，不同研究所测得组织蛋白酶B的含量可能与体内外实验、牙周炎进展时期等多种条件因素相关，现阶段可证明组织蛋白酶B与牙周炎发生、发展具有相关性，但具体相关程度及机制有待进一步探索。

1.3 组织蛋白酶C

组织蛋白酶C属于溶酶体半胱氨酸蛋白酶，是番木瓜蛋白酶家族成员。编码组织蛋白酶C的基因由7个外显子和6个内含子组成，定位于染色体11q14-21。组织蛋白酶C是463个氨基酸组成的序列，又被称为二肽基酶，能够去除肽链末端的二肽，同时具有肽链内切酶的活性[24]。

组织蛋白酶C对于嗜中性粒细胞颗粒相关的丝氨酸蛋白酶翻译后的修饰十分重要；还可以激活淋巴细胞的颗粒酶，调节免疫反应[25]。它在中性粒细胞、巨噬细胞及前体、细胞毒性T淋巴细胞等免疫细胞中高度表达，与免疫调节、蛋白质降解、酶原激活等机体活动密切相关[24]。

组织蛋白酶C与掌跖角化-牙周破坏综合征（Papillon-Lefèvre syndrome，PLS）关系密切。PLS是一种常染色体隐性遗传病，特点是手掌足底过度角化和早期重度牙周炎。组织蛋白酶C基因突变被认为是PLS的致病基础[24]。王津津[26]研究发现，组织蛋白酶C在牙龈炎组和牙周炎组牙龈中的表达明显高于健康牙周组，伴随着细胞分化状态（CK19和CK10表达增加）和免疫状态（TLR4增加）的改变。在组织蛋白酶C基因中现已发现70余种致病突变。

组织蛋白酶C激活蛋白酶需进行N-末端氨基酸的剪切，然而当组织蛋白酶C功能失活时，表达组织蛋白酶C较高的天然杀伤（natural killer，NK）细胞、T细胞等缺乏激活的颗粒酶A和B，其功能发生障碍，使机体抵抗病原体能力受损，从而使机体易感性增加[25]。有趣的是，Khan等[27]报道了已发现5例无组织蛋白酶C基因突变的PLS患者。由此看来，组织蛋白酶C能否作为PLS早期的筛查手段现还有待进一步考证。另外，Türkoğlu等[28]研究表明，在慢性牙周炎、广泛侵袭性牙周炎、牙龈炎患者龈沟液中未发现组织蛋白酶C与牙周病严重程度呈正相关。因此，组织蛋白酶C在牙周组织炎症反应中扮演的重要角色以及作用机制有待进一步探索。

1.4 组织蛋白酶G

不同于上述溶酶体半胱氨酸蛋白酶，组织蛋白酶G是丝氨酸蛋白酶家族的一员，在嗜中性粒细胞中广泛表达，也发现其在肥大细胞和单核细胞中表达，参与主要组织相容性复合物（major histocompability complex，MHC）Ⅱ的抗原递呈过程，其基因的调控与慢性阻塞性肺疾病、克罗恩病、类风湿性关节炎、肿瘤等疾病密切相关[29]。

组织蛋白酶G在成人牙周炎的牙龈组织和龈沟液中浓度较高[30]。在牙周炎的进程中，组织蛋白酶G在中性粒细胞中表达，可通过激活MMP-8，从而降解细胞外基质，造成牙周组织破坏[30]。然而，Kurtulus等[31]通过免疫组织化学染色证明，组织蛋白酶G在牙龈炎和牙周炎患者中表达较低，Gul等[32]通过检测慢性牙周炎患者酶谱发现，经过牙周治疗后，组织蛋白酶G浓度并无特异性改变。由此可见，目前对组织蛋白酶G在牙周炎患者中的表达以及作用机制尚未达成共识。

2 组织蛋白酶抑制剂

理想的抑制剂应具有高度选择性，存在最小的肽单元，具有良好的生物药效率、较高的膜通透性、较长的血浆半衰期以及在溶酶体中可利用性[33]。其中，内源性抑制剂主要有：前体肽、Cystatin家族（包括stefins、cystatins、kininogens大类）、Serpin家族、Thyropins类、α2巨球蛋白细胞毒性T淋巴细胞抗原-2β等；合成肽类抑制剂主要有：醛类、酮类、腈类、环氧琥珀酰类、乙烯基砜类等。组织蛋白酶抑制剂主要有减少肿瘤转移与侵袭、降低组织胶原溶解与破坏、抑制骨基质降解等作用，其研究为预防和控制牙周疾病、降低牙周组织的损伤提供了靶点，对临床应用具有重要指导意义。

2.1 组织蛋白酶K抑制剂

组织蛋白酶K的内源性蛋白抑制剂有stefin B、cystatin C等，合成肽类抑制剂有二肽苯氧甲基酮、肽类乙烯基砜化合物等。组织蛋白酶K抑制剂对于预防和治疗骨吸收具有显著作用，通过不同靶点抑制组织蛋白酶K进而防止骨吸收的药物已经进入临床试验，如抗再吸收剂双膦酸盐、降钙素、雌激素和抗RANKL抗体以及促进骨形成的甲状旁腺激素等[34]。现阶段的研究热点主要集中在对于肿瘤以及骨质疏松症的治疗。

其中，双膦酸盐通过抑制破骨细胞活性，广泛应用于恶性肿瘤骨转移、多发性骨髓瘤的治疗，然而应用双膦酸盐导致颌骨坏死这一不良反应近年来得到持续关注和报道。其具体发病机制尚不明确，推测可能与时间和剂量相关[34]。

Odanacatib是一种组织蛋白酶K抑制剂，作为最有前景的治疗骨质疏松症的药物，可以阻止组织蛋白酶K与底物结合，现在已进入Ⅲ期临床试验，然而其有诱发心血管疾病的风险，导致研发遗憾终止[35]。

就目前研究进展来看，组织蛋白酶K在牙周炎中的作用机制较明确，其抑制剂的研究对于口腔骨吸收疾病防治意义较大、前景较好。

2.2 组织蛋白酶B抑制剂

组织蛋白酶B的内源性蛋白抑制剂有stefin A和B、cystatin C等，其中stefin A抑制力较强，cystatin C对于组织蛋白酶B具有较大亲和力。合成肽类抑制剂有CA074和CA030、吡咯酮类物质等[36]，其中由于CA074对组织蛋白酶B有较高的选择性和不可逆性，现阶段研究较为广泛[37]。

2.3 组织蛋白酶C抑制剂

组织蛋白酶C抑制剂研发的主要挑战是药物的代谢稳定性和体内的半衰期。在合成不可逆抑制剂中，二肽重氮甲基酮选择性较强[38]。

2.4 组织蛋白酶G抑制剂

在组织蛋白酶G抑制剂中，目前认为b-酮膦酸衍生物、氨基烷基膦酸酯和乳香酸最具开发前景[29]。

3 总结与展望

组织蛋白酶在机体内的调控表达对全身健康的影响具有重要意义。而在牙周疾病进程中，组织蛋白酶K的作用机制相对较明确，其可以通过调控RANK-RANKL信号通路，经NF-κB、NFAT途径促进破骨细胞的分化，进而控制牙周组织中骨组织的代谢，同时也参与牙周疾病的免疫炎症反应。推测组织蛋白酶B与牙周炎的关系可能与TLR2/NF-κB途径有关，组织蛋白酶B可通过慢性活化TLR2/NF-κB通路，降解Ⅲ型和Ⅳ型胶原，造成牙周组织损伤。组织蛋白酶C与PLS密切相关，其基因突变被认为是PLS的致病基础。组织蛋白酶G也被发现与牙周炎有关，但作用机制尚不明确。

由于牙周炎的进程复杂、机制多样，难以依靠单一的生物标志物反映牙周炎的进展，组织蛋白酶的研究为牙周炎标志物提供又一种可能的参考。以组织蛋白酶为标志物，对牙周炎发生、发展的监测有较深刻的意义，通过控制牙周组织内的组织蛋白酶来控制牙周病的发展及牙周组织的破坏，将有望成为牙周炎防治的重要措施。因此，组织蛋白酶在体内的具体病理及生理作用，还需进一步研究及完善。