诱导多能干细胞治疗年龄相关性黄斑变性的研究进展

卢怡洁，秦 珊，秦 波

0引言

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，ARMD)是在全球范围内造成失明的主要原因之一，预计到2020年，将会有1.96亿的患者罹患ARMD，而其中1 100万患者将会有严重的视力丧失，这对患者的生活质量有着巨大的影响[1]。ARMD主要分为两类，萎缩性和渗出性，其中渗出性ARMD约占总ARMD患者的10%。目前对于萎缩性ARMD缺乏有效的治疗方法。而对于渗出性ARMD，眼内注射抗血管内皮生长因子(anti-vascular endothelial growth factor，anti-VEGF)已成为常用的治疗方法。但是抗VEGF治疗所针对的患者类型十分有限，且该治疗也有其局限性[2-3]。RPE细胞为有色素的六角形极化单层细胞，在视网膜稳态中发挥着关键作用[4]。在萎缩性ARMD的晚期，视力丧失主要是由于RPE以及光感受器细胞萎缩导致的脉络膜毛细血管继发性丧失引起的。这提示我们需要引入替代细胞和/或营养因子来重建视网膜解剖结构。近几年来，随着再生医学领域的不断发展，使得干细胞移植成为了最具潜力的有望治疗ARMD的方法。目前的干细胞来源主要为两类，胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)。目前ESC来源的视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium，RPE)已被证实可以在视网膜退行性病变的动物模型中移植并且发挥功能[5]，然而ESC来源的干细胞难以回避道德和伦理问题，并且存在免疫排斥和来源不足的问题。iPSC的出现为干细胞生物学领域带来了新的转变，提供了多能细胞的替代来源。本综述将在ARMD的背景下论述关于iPSC细胞的相关研究以及持续存在的挑战。

1诱导多能干细胞及其衍生的视网膜色素上皮细胞

最初，iPSC是由Yamanaka等将4种转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-myc通过逆转录病毒转导入小鼠皮肤成纤维细胞所得[6]。这些“重编程”的细胞具有分化为体内任何细胞的能力，同时避免了道德和伦理方面的相关问题，引入了使用自体细胞对患者进行特异性疗法的可能性。因为移植细胞来自于患者自身，原则上不引起免疫反应，因此消除或减少了免疫抑制治疗的需要。自从2006年以来，该技术已经被用于重编程来自不同物种的体细胞，其中包括大鼠、狗、恒河猴以及人类[7-10]。眼球作为理想的干细胞移植器官，其相对于身体的其他器官处于天然的免疫豁免状态，而且与其他器官相比，眼球的大小决定了其只需较少的细胞数量即可完成移植。iPSC-RPE细胞已经被证实在体内与体外都具有RPE细胞的形态和功能特征，例如表达RPE特异性标记，如闭合小带蛋白-1(ZO-1)，而且具有执行关键功能的潜力，如与天然RPE类似的处理维生素A的能力[11]，并且可以分泌抑制免疫反应的可溶性抑制因子，如TGF-β2、血小板反应蛋白-1(TSP-1)等[12]。这些结果均表明，iPSC已经能够成功衍生出与天然RPE相似的RPE细胞，为ARMD的干细胞治疗提供了基础。

2诱导多能干细胞衍生的RPE细胞治疗ARMD的临床前研究

为了测试iPSC-RPE细胞疗法的功效，许多研究者利用动物模型进行验证研究。皇家外科医学院(royal college of surgeons，RCS)大鼠为最常用于检测ARMD细胞疗法的动物模型，这种视网膜退行性动物模型患有原癌基因酪氨酸激酶(MERTK)的基因突变，将会导致RPE和视网膜变性，从而破坏外节段吞噬作用[13]。研究证明，视网膜下腔移植来自非营养不良大鼠、胎儿、新生儿和成人作为供体所衍生的iPSC-RPE细胞可不同程度地延迟RCS大鼠的疾病发作，并且可以预防或逆转RPE的退化[14-17]。Li 等[18]将iPSC-RPE细胞注射到出生后第2d的视网膜变性小鼠模型(Rpe65rd12/Rpe65rd12)的一只眼的视网膜下空间，使用对侧眼作为对照，研究显示移植后长期存活的iPSC来源的RPE与宿主原生的RPE细胞共定位，并且移植6wk后的视网膜电图(electroretinogram，ERG)，即受体的视觉功能得到了改善，为应用iPSC移植治疗视网膜退行性变的临床相关模型提供了功能恢复的直接证据。同时该试验进行了长达6mo的随访研究，显示在任何移植的小鼠中均未检测到畸胎瘤，表明了iPSC-RPE的安全性和有效性。Sun等[19]则将iPSC-RPE细胞注射到免疫抑制的视网膜色素变性模型rd1小鼠的视网膜下空间，发现人iPSC-RPE细胞在术后第14d和第21d明显减轻了小鼠的光感受器变性，延迟了光感受器退化。Kamao等[20]将来自于非人灵长类食蟹猴自体诱导的多能干细胞进行自体移植，证实移植后iPSC-RPE细胞片没有出现免疫排斥或肿瘤形成，表明了iPSC-RPE细胞片可作为一种有效的移植形式用于组织替代治疗ARMD。当然，这种视力挽救是由于替换的RPE细胞还是由于植入的RPE细胞所分泌的生长因子所起的旁分泌作用仍有待确定，但是小型、大型的动物模型的诸多实验结果为iPSC细胞进入人体试验研究铺平了道路。

3基于iPSC的视网膜色素上皮细胞移植的临床研究

目前使用iPSC衍生的RPE细胞片进行临床试验的研究非常有限。日本Riken发育生物学中心报道了第1个也是唯一一个接受iPSC-RPE细胞片视网膜下移植患者的临床报告。2014-09，1例患有渗出性黄斑变性(息肉状脉络膜血管病变)的日本女性患者在视网膜下腔植入了由自身成纤维细胞产生的iPSC衍生的RPE细胞片。患者未接受免疫抑制治疗，在移植后1a的时间点没有出现不良反应，且移植的细胞保持完整，视力未再出现下降，光学相干断层扫描(OCT)显示移植部位出现高密度区域，提示感光细胞内部以及外部区段的恢复可能。但在2015-03该试验被用于第2例患者时，由于发现了iPSC中的遗传突变，该试验被迫搁置[21-23]。虽然尚不清楚这些遗传突变是来自于重编程中的诱导还是来源于患者的体细胞，但是这也提示我们在进入人体试验之前必须评估基因组的稳定性。为了避免来自于个体的基因组异常的可能性，Sugita等使用来自部分匹配供体的iPSC，这些细胞不仅可以验证基因组的稳定性，同时还可以加速细胞生产过程。他们的研究成果证明，来自主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)纯合子供体的细胞可以用于组织相容性受体视网膜疾病的治疗。在该研究中，研究人员将来自于MHC纯合动物的iPSC衍生的RPE细胞移植到没有免疫抑制的MHC匹配的动物模型中，发现iPSC衍生的RPE同种异体移植物未出现免疫应答或排斥。这些研究表明，如果供体是MHC或者HLA匹配，iPSC衍生的RPE细胞同种异体移植可能是成功的，且几乎没有免疫抑制[24-25]。Sugita等所提出的同种异体HLA匹配的干细胞治疗方法为自体iPSC提供了替代方案，也更丰富了ARMD相关的细胞治疗思路。

4基于iPSC的视网膜色素上皮细胞移植所面临的挑战

基于iPSC治疗的首先需要面对的问题就是其耗费时间长和昂贵的费用，特别是对于自体来源细胞的移植治疗。据估计，自体来源细胞治疗的制备需要3mo才能完成，从采集到眼内植入大约需要花费100万美元[26]。同种异体HLA匹配细胞的使用可能更为有效、经济，同时也适合大批量生产使用。

其次就是移植后的致瘤性和安全性方面的考虑，iPSCs的发育需要重编程体细胞，方法包括通过病毒转染或者化学诱导等将外源转录因子传递到细胞中[27]，病毒载体可以是整合或者非整合的，因此具有突变或者免疫原性的可能[28]。虽然Kanemura等[29]研究证明，在啮齿动物模型中iPSC衍生的RPE细胞的致瘤性是可以忽略不计的，但是还需要更多的体内研究来进一步佐证。而在遗传性视网膜疾病中，引起疾病的突变仍有可能存在于iPSC衍生的细胞中，因此如何利用基因编辑技术修复存在的遗传缺陷并制造健康的细胞也是面临的问题之一。此外iPSCs移植的长期安全性也未可知，迄今的动物研究最长观察时间为6～9mo，因此尚不清楚其长期的致瘤性。另一亟待解决的安全性挑战便是自体来源和异体来源干细胞衍生的RPE细胞的免疫反应。

所有基于细胞治疗干预措施的主要挑战为确保细胞能够整合到宿主视网膜中，即移植的细胞必须整合到现有的神经回路中发挥正常功能。Zhong等[30]发现培养的人类iPSCs再现了体内视网膜发育的主要过程，形成了包含主要视网膜细胞类型的3D视网膜杯，并显示出视网膜外节盘的形成和光敏性。Lamba等[31]同样观察到来源于iPSCs的光感受器细胞移植入视网膜下腔空间后不仅能够存活，并且在视网膜外核层发现了移植细胞，这表明iPSCs具有迁移并整合于视网膜的能力。尽管在动物模型中取得了成功，但是如何增加移植细胞与宿主视网膜整合能力又是一个新的挑战。干细胞移植方法的选择与生物材料的改进，决定了移植细胞能否长期存活以及是否发挥作用。目前，将细胞递送到视网膜下空间主要有两种方法，一种为将干细胞衍生的RPE悬浮液注射到视网膜下空间；另一种则是将干细胞衍生的RPE细胞接种于支持膜(可生物降解和/或具有生物相容性的支架或生物膜)上形成单层的RPE细胞片进行移植。鉴于晚期ARMD患者Bruch膜的异常程度，与单个RPE细胞悬液视网膜下注射相比，具有支撑层的RPE细胞移植片被认为更有效。目前研究人员已经集中开发不同材质的生物材料聚合物支架，如胶原凝胶、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)支架、聚酰亚胺膜、血浆聚合物、聚对二甲苯-C膜、聚酯膜、聚酰胺纳米支架[20, 32-37]等，这些聚合物与Bruch膜作用相似，可以为RPE提供支持与营养，同时可以设计具有特定的特性，例如特定的降解速率[38]。

iPSC衍生的RPE细胞理论上是可以替代在ARMD中受损的RPE细胞，但是实际移植的RPE细胞能够发挥多少功能，能否替代原来的RPE细胞所必须的基本功能以减缓甚至逆转疾病的进展还有待观察。而且即使移植的RPE细胞能发挥正常的生理功能，其在ARMD病理环境中能否成功移植以及长期存活都需要进一步的研究来探讨。

5展望

iPSC在治疗ARMD中有巨大的潜力，但仍存在必须要跨越的障碍。通过iPSCs的培养和疾病建模，让我们对视网膜变性疾病领域有了更新的理解。而在未来的应用中，更重要的是优化重编程方法，开发高效的分离、分化方法，改进干细胞来源的细胞注入患者的方法，例如使用支架或者生物膜等支持材料，同时测试安全性和完整性，并能监测移植后细胞的长期存活情况。