葡萄籽原花青素抑制人骨肉瘤MG63细胞增殖的机制研究*

于长水徐佳元 王春雷 陶学强

（哈尔滨医科大学第一临床医学院骨科，哈尔滨150001）

骨肉瘤（osteosarcoma,OS）是一种原发性骨骼恶性肿瘤，其组织学特征是间充质来源的梭形细胞沉积未成熟的类骨质基质[1]。OS的美国年发病率为0.0031‰，是儿童骨骼中最常见的原发性恶性肿瘤[2]，具有极高的转移潜能。目前，新辅助化疗联合根治性手术可将OS的5年生存率提高至70%[3]，但化疗药物也带来了诸如骨髓抑制、肝肾功能损害等副作用，严重影响着患者的生存质量[4]。故临床上迫切需要新型的高效低副作用的抗OS药物。原花青素（proanthocyanidin,PC）是植物中广泛存在的一类多酚化合物的总称，由不同数量的儿茶素或表儿茶素结合而成，属于生物类黄酮，具有提高免疫、减轻机体损伤、抗氧化和抗炎等活性，且毒性更低[5-7]。1961首次从山楂新鲜果实的提取物中分离得到PC，后又相继在葡萄、花生、大黄、银杏等植物中发现，其中以葡萄籽和松树皮中含量最高。最新研究发现，葡萄籽PC能够抑制包括肺癌、肝癌、结肠癌等多种癌细胞的增殖，促进其凋亡，但其对于OS MG63细胞的作用及机制尚无相关研究报道[8-10]。本研究旨在探讨葡萄籽PC对OS MG63细胞的增殖抑制以及对其细胞周期的阻滞，为葡萄籽PC作为潜在的治疗OS药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂

人OS细胞株MG63（中国科学院上海细胞库），葡萄籽PC（质量分数＞950 g/L，广东方晟公司），胎牛血清、胰蛋白酶、100×青/链霉素、高糖DMEM培养基（Gbico，美国），MTT（Promega，美国），细胞周期检测试剂盒（BD，美国），一抗稀释液、二抗稀释液（碧云天，中国），PVDF膜（Millipore，美国），发光液（Thermo scientific，美国），一抗兔抗人 cyclinA、cyclinB1、CDK1、CDK2、p21、p27（Cell Signaling Technology，美国），辣根过氧化酶标记的二抗羊抗兔（Santa Cruz，美国），蛋白免疫印迹以及明胶酶谱相关试剂（碧云天，中国），其他试剂均为国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养和分组：取液氮保存OS MG63细胞复苏，用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM高糖完全培养基，于37°C、含5%CO2的恒温培养箱中培养。当细胞处于对数增殖期时，用0.25%胰蛋白酶消化传代，进行后续实验。按照培养基中加入不同浓度的葡萄籽PC分为4个组，分别为空白对照组、30 μg/ml葡萄籽PC组、60 μg/ml葡萄籽PC组和90 μg/ml葡萄籽PC组。

1.2.2 MTT法测MG63细胞增殖：取对数生长期MG63细胞，0.25%胰蛋白酶消化单层MG63细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养基配成细胞悬液并计数，以每孔6×103个细胞数接种于96孔板中。待细胞贴壁，无血清培养基培养24 h使细胞同步化。各组细胞加入不同浓度的葡萄籽 PC（0 μg/ml、30 μg/ml、60 μg/ml、90 μg/ml），每组设3个复孔，2个不加细胞的空白孔。细胞在各自条件下培养24 h、48 h和72 h。培养结束后，每孔加入MTT液20 μl，37℃下继续孵育4～6 h，小心弃去培养上清液，每孔加入150 μl二甲基亚砜（DMSO）溶液，振荡10 min，选择492 nm波长在酶联免疫检测仪测定各孔光密度（optical density,OD）值并记录。以时间为横轴，吸光值为纵轴绘制MG63细胞生长曲线。

1.2.3 碘化丙啶（propidium iodide,PI）单染色流式细胞术检测细胞亚二倍体百分率和细胞周期：取对数生长期MG63细胞，调整细胞浓度为1.0×105/ml，接种于6孔板，总体积1 ml。12 h后分别加入质量浓度为0 μg/ml，30 μg/ml，60 μg/ml，90 μg/ml的葡萄籽PC培养。培养48 h后，消化收集细胞，离心速率1000 r/min，离心6 min后弃去上清。用预冷浓度为0.01 mol/L的PBS液重悬细胞，离心、洗涤2次，用体积分数为70%乙醇4℃固定过夜。上机前用预冷的PBS液洗涤3次后，加入PI染色液（含RNA酶），终质量浓度5.0×10-2g/L，避光染色30 min，300目尼龙网过滤后使用流式细胞仪分析细胞DNA含量的变化，每个样本随机分析10000个细胞。

1.2.4 Western印迹法测定MG63细胞中各蛋白的表达：用含60 μg/ml的葡萄籽PC处理MG63细胞48 h后，裂解MG63细胞并提取细胞总蛋白，BCA法定量蛋白含量，等量样品以体积分数12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）分离蛋白质。切胶转膜，体积分数5%的脱脂奶粉封闭后，加入一抗，4°C孵育过夜，次日洗膜后加入二抗，37°C孵育1 h，洗后显影采集图像，用Quantity One软件分析灰度值，用以β-actin或histone为内参，计算目的蛋白与内参的比值。

1.3 统计学处理

应用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差表示，不同处理组的差异采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 葡萄籽PC对MG63细胞增殖的影响

MTT结果显示，在同一时间点，MG63细胞的生长情况随葡萄籽PC浓度增加而影响增大；在葡萄籽PC浓度相同的情况下，MG63细胞的生长情况随作用时间的延长而影响增大；葡萄籽PC呈浓度和时间依赖性抑制MG63细胞增殖（表1）。

表1 MTT法检测不同浓度及时间条件下葡萄籽PC对MG63细胞增殖的影响（±s，%）

表1 MTT法检测不同浓度及时间条件下葡萄籽PC对MG63细胞增殖的影响（±s，%）

注：△与0 μg/ml组比较，P＜0.05；▲与0 μg/ml组比较，P＜0.01

72 h 100 71.8±8.3▲65.7±5.5▲32.8±2.9▲GSP浓度0 μg/ml 30 μg/ml 60 μg/ml 90 μg/ml 24 h 100 89.6±6.8△71.7±10.8▲47.6±7.4▲48 h 100 79.8±4.5▲68.5±4.2▲41.6±3.3▲

2.2 葡萄籽PC对MG63细胞周期的影响

PI单染色流式细胞术结果显示，葡萄籽PC诱导MG63细胞G2/M期和S期阻滞，用不同浓度的葡萄籽PC分别处理MG63细胞48 h后，收集并固定细胞以检测细胞周期。结果显示，与同期空白对照组相比，各个葡萄籽PC处理组的细胞S期比例上升，G2/M的比例上升，而G0/G1期比例下降，且以上数据变化具有葡萄籽PC浓度依赖性（表2）。

2.3 Western印迹结果

使用不同浓度的葡萄籽PC处理MG63细胞48 h后使用Western印迹检测其cyclin A、cyclinB1、CDK1、CDK2、p21和p27表达水平的变化，结果显示以与G2/M期进展相关的cyclinB1和CDK1表达水平随着葡萄籽PC浓度的升高而升高，与S期进展有关的CDK2和cyclinA的表达水平随着葡萄籽PC浓度的升高而升高，与肿瘤增殖抑制作用相关的p21、p27表达水平同样随着葡萄籽PC浓度的升高而升高（图1）。

表2 葡萄籽PC处理MG63细胞48 h后细胞周期各阶段分布比例（±s，%）

表2 葡萄籽PC处理MG63细胞48 h后细胞周期各阶段分布比例（±s，%）

注：△与0 μg/ml组比较，P＜0.05；▲与0 μg/ml组比较，P＜0.01

G2/M期33.4±2.5 36.9±4.4 39.1±7.3 44.3±2.0▲GSP浓度0 μg/ml 30 μg/ml 60 μg/ml 90 μg/ml G0/G1期59.5±6.8 54.3±6.1 46.2±3.2△30.1±6.4▲S期7.2±1.2 8.8±1.2△14.8±2.4▲25.6±2.9▲

图1 Western印迹法检测不同浓度GSP处理MG63细胞48 h后 cyclinA、cyclinB1、CDK1、CDK2、p21、p27 的表达水平

3 讨论

OS是来源于间叶组织的儿童和青少年最为常见的骨原发性恶性肿瘤，具有高侵袭性、高转移性、高致死率等特点[11,12]。目前，临床上对于OS的治疗方法以新辅助化疗联合根治性手术治疗为主，虽然化疗提高了患者的5年生存率，但是化疗药物均具有较高的毒副作用，对于患者的肝、肾、血液体统等均会造成较大的损害；此外，化疗所需的周期较长，在增加患者痛苦的同时也增加了OS细胞的耐药性，使化疗效果大打折扣，最终导致长期生存率降低[13,14]。因此，开发高效低副作用的新型化疗药物对于提高OS患者的治愈率、生存率具有重要意义[4]。

PC是一类广泛存在于自然界中的一大类聚多酚类化合物，其在酸性介质中受热可转变为花青素；其广泛分布在植物中，尤以葡萄籽中含量最高，葡萄籽中PC的提取量可达2.05%[15]。葡萄籽PC是由不同数量的儿茶素、表儿茶素、没食子酸及没食子酸酯等结合而成的单体或多聚体[16]。研究发现，葡萄籽PC具有抗炎、抗氧化、预防和减轻化疗损伤的作用，且毒副作用小、生物利用度较高[17]。越来越多的学者开始关注葡萄籽PC的抗肿瘤作用。研究发现，葡萄籽PC对肺癌、前列腺癌、乳腺癌、直肠癌等多种肿瘤细胞的抑制增殖和促进凋亡的作用[9,15,18,19]。Fishman等[20]研究发现葡萄籽PC可以通过下调细胞周期调控因子cyclinE、CDK2和CDK4，引起G0/G1周期阻滞，从而抑制人膀胱癌T24细胞生长。Prasad等[21]研究发现，葡萄籽PC能够通过将胰腺癌细胞阻滞在G2/M期，从而降低胰腺癌细胞的增殖。谢佳卿等[22]研究发现，葡萄籽PC引起G0/G1周期阻滞和周期相关蛋白cyclinD1下调，还使细胞凋亡率明显增高，并认为其涉及Wnt/β-catenin信号通路的抑制。迄今为止，葡萄籽PC在人OS MG63细胞株中的作用尚无报道。本研究采用不同浓度葡萄籽PC处理人OS MG63细胞，发现不同浓度葡萄籽PC均能够抑制OS MG63细胞的增殖，且这种抑制作用具有时间和浓度依赖性；此外还发现，葡萄籽PC可以将MG63细胞阻滞在G2/M期和S期，提示葡萄籽PC具有成为治疗OS新药的潜力。

本研究仅通过体外实验对MG63细胞系进行了细胞增殖抑制、细胞周期阻滞方面的研究，尚不能深刻理解葡萄籽PC抗OS的复杂过程。今后将利用包括人类OS细胞株143B、SAOS-2等进行更加深入的研究。

综上，葡萄籽PC可抑制OS MG63细胞的增殖，这种抑制作用呈浓度和时间双重依赖性；葡萄籽PC以时间依赖性方式显著下调了与G2/M期进展相关的cyclinB1和CDK1，显著上调了细胞周期抑制蛋白p21、p27；证实葡萄籽PC对于OS MG63细胞增殖的抑制作用是通过将细胞周期阻滞在G2/M期而实现的。本研究为葡萄籽PC成为潜在的抗OS药物、阐明葡萄籽PC抑制OS的分子机制和将G2/M期作为OS潜在靶点提供了部分实验依据。