代谢组学在颅脑创伤中的应用研究进展▲

秦雅静 符 锋 陈忠彦 孙洪涛 钟瑞霞 刘 洋

(1 中国人民武装警察部队特色医学中心神经危重症医学科，天津市 300162，电子邮箱：272140356@qq.com；2 上海市第四人民医院神经内科，上海市 200081)

【提要】 颅脑创伤是人类致残、致死的主要原因之一。由于受伤机制和脑组织的复杂性，颅脑创伤可诱发广泛的病理生理学改变。代谢组学可提供颅脑创伤患者单一时间点生理、生化状态的“瞬时快照”。目前，高通量、高灵敏度的代谢组学分析工具能够检测和定量小浓度的代谢物，使客观化、精细化评估颅脑创伤成为可能。本文就代谢组学的概况及其在颅脑创伤诊疗、预后评估等方面的研究进展做一综述。

颅脑创伤是由外部机械力引起的神经学损伤，为人类致残、致死的主要原因之一，遗留的神经功能和认知障碍给患者及其家庭带来巨大影响[1]。调查研究显示，全球每年新增5 200万～5 600万轻度颅脑创伤患者和2 200万～3 600万中重度颅脑创伤患者[2]，2017年全球因颅脑创伤造成的经济负担为3 620亿～4 450亿美元，相当于全球生产总值的0.5%[2]。目前，临床评估和神经影像学是颅脑创伤诊断与预后评估的主要手段，但由于颅脑创伤的损伤机制和临床症状的异质性使目前的评估方法尚不能满足颅脑创伤患者的个性化治疗，尤其是轻度和中度颅脑创伤患者[3]。代谢物是体内所有生物化和病理生理过程的组成部分，目前的高通量和高灵敏度的分析工具能够检测和定量低浓度的代谢物。因此，以生物液体为样本的代谢组学检测技术在颅脑创伤诊疗和预后评估方面较单纯的临床症状及神经影像学可能更可靠、实用。本文就代谢组学及其在颅脑创伤诊疗及预后评估中的研究进展进行综述。

1 代谢组学概况

1.1 代谢组学的基本特征 代谢物组是某一时刻生物体内所有代谢物的集合，其浓度随宿主对内部或外部刺激后病理生理的变化而变化，反映环境因素和遗传因素在宿主表型上的相互作用。代谢组学是对小分子代谢物(分子量<1 kD)识别和量化的整合研究[4]，可分为靶向代谢组学和非靶向代谢组学。靶向代谢组学被用于定量数量有限的已知代谢物，而非靶向方法用于半定量尽可能多的代谢物(包括样品中已知和未知的代谢物)[5]。血液、唾液、尿液、痰液、支气管肺泡灌洗液、眼泪、粪便、精液、脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)和呼出气冷凝物等多种样品均可用于代谢组学研究。代谢产物可能是病因特异性的或非特异性的标志物，取决于样品来源和涉及的生物学途径[6]。因此，代谢组学已经改变了“生物标志物”的概念，其不仅可量化代谢物，还识别疾病的代谢模式，即代谢指纹或生物模式[7]。代谢组学提供了在特定时间点细胞或组织(器官)的分子状态的综合视图，包括在基因组学或蛋白质组学分析中未见到的表观遗传学影响。如果在临床表现出现之前检测到代谢改变的信号，则可能早期诊断和治疗某种疾病，从而增加成功治疗或治愈的可能性。

1.2 代谢组学分析平台 用于代谢组学研究的高通量分析平台可以分为检测技术和分离技术或两者的组合。其中，核磁共振光谱(nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR)和质谱(mass spectrum，MS)用于检测代谢物，气相色谱(gas chromatography，GC)或液相色谱(liquid chromatography，LC)用于分离代谢物[8]。而GC-MS和LC-MS等联用技术是高灵敏度和准确度的分析工具，两者已被广泛应用于鉴定人类生物样品中的数千种代谢物。

GC-MS可以用于半定量鉴定低浓度的化合物，尤其是挥发性化合物。衍生化方法可以增加非挥发性化合物的挥发性和热稳定性，以便用于GC-MS分析。基于不同分子对由特殊聚合物制成的固定相亲和力的差异，可在气体加热柱(气相色谱)中彻底分离生物样品中的衍生分子。根据分子的质荷比，质谱仪在复杂的物理化学过程中离子化和鉴定每个分子。分离和检测技术的结合可根据保留时间和质荷比确定化合物，由此成为代谢组学高分辨率工具[9-10]，如增强型色谱柱、离子源、质量分析仪和化合物文库等GC-MS领域最新的创新性发展技术，提高了鉴定代谢物的灵敏度和特异性。GC-MS可用二维方法(即二维色谱模式)，如串联层析(GC/GC-MS)或串联质谱分析仪(GC-MS/MS)，以增强代谢物的鉴定效果，从而检测出在常规GC-MS中未能被识别的多种化合物[11]。

LC-MS是一种功能强大、灵敏度高的代谢组学分析技术，仅需少量样品且无须高温条件就可检测代谢物。该技术在LC中通过流动相(溶剂)和固定相之间的相互作用将化合物分离，并在质谱仪中鉴定分离出的化合物。LC-MS是一种极其敏感的代谢组学方法，能够检测小于1 pg的分子[12]，其是识别非极性、非挥发性、半极性化合物和热不稳定化合物的可靠技术[13-14]。目前高压GC-MS、超高压GC-MS和亲水相互作用LC-MS均已被用于代谢组学的研究。

2 代谢组学在颅脑创伤中的应用前景

异质性是影响颅脑创伤诊断和预后的主要难题，格拉斯哥昏迷量表(Glasgow Coma Scale，GCS)评分、创伤后应激障碍持续时间、伤后天数、多发伤以及头部损伤次数均是影响颅脑创伤异质性的重要因素。目前的影像技术和临床评估方法评估神经损伤的敏感性低，而使用单一代谢物作为诊断生物标志物的研究并不可行[15]。代谢组学可以通过代谢谱对患者进行聚类来降低诊断颅脑创伤的异质性，其有望成为精确诊断颅脑创伤的技术，尤其是适用于轻度颅脑创伤[16]。

颅脑创伤的预后评估也是神经科医师面临的一个挑战，年龄、性别和遗传因素等因素均可能影响患者的病程和预后。通过测定新型代谢生物标志物的变化以区分颅脑创伤的各个阶段，有助于评估患者的预后[17]。基于代谢组学技术分析出的小分子代谢物可用于准确识别易发生后遗症的患者，进而有助于针对个体进行特殊康复治疗。

代谢产物可作为鉴别局灶性和弥漫性颅脑损伤、原发性和继发性颅脑损伤的生物标志物[18]。由于代谢物的浓度和类型可能会随着受损区域的变化而变化，因此代谢组学可以用于定量评估颅脑损伤，如神经元特异性烯醇化酶、S100β和血影蛋白分解产物等蛋白质生物标志物的浓度在局灶性与弥漫性颅脑损伤患者中存在差异[18]。此外，在目前缺乏敏感的神经影像学技术用于识别特定解剖学损伤的情况下，基于颅脑创伤的损伤解剖位置呈特异性改变的代谢物检测可更好地对患者进行分类并预测结局。研究表明，对于重复性颅脑创伤，代谢组学可能有助于识别具有高复发性脑震荡风险的运动员，或更准确地评估复苏进展；连续采样及监测生物标志物可以阐明患者的情况、确认重复性颅脑创伤引起的累积效应、识别与执行功能缺陷相关的模式，以防止脑震荡的反复发作[19]。

3 代谢物-生物标志物在颅脑创伤中应用的研究进展

3.1 代谢物-生物标志物有助于探索颅脑创伤病理生理学机制 了解颅脑创伤相关代谢物的变化可以揭示颅脑创伤病理生理级联信息，从而探索潜在的干预靶点。颅脑创伤患者CSF和血液中的代谢物浓度常常不同，CSF中的代谢物可用于评估颅脑创伤患者血脑屏障的功能性。代谢物分析可以用于阐明颅脑创伤继发性损伤所涉及的细胞和分子机制[20]，基于代谢组学的研究有助于预防或减少颅脑创伤继发性损伤。

谷氨酸、甘氨酸和天冬氨酸是大脑内的主要神经递质。谷氨酸是一种兴奋性神经递质，可激活N-甲基-D-天冬氨酸受体，从而介导广泛的生物学效应[21]。颅脑创伤发生后由于神经功能障碍和细胞死亡，脑代谢明显增加，易因缺氧、低血压和癫痫发作而造成颅脑继发性损伤；糖酵解使血清乳酸水平增加，进而导致神经元功能障碍并损害血脑屏障，最终导致脑水肿[22]。代谢物-生物标志物可反映颅脑创伤后功能性脑损伤、继发性脑损伤和神经代谢级联的时间过程，包括评估膜结构响应代谢、ATP依赖性离子泵、细胞能量代谢和脑血流量。高通量分析工具能够识别与代谢变化、离子和微丝化合物改变相关的轴突损伤代谢物，如监测到过量的兴奋性氨基酸神经递质(如谷氨酸、磷脂酰丝氨酸等)，则提示细胞凋亡的开始[23]。

3.2 代谢组学在颅脑创伤动物模型中的应用 动物模型已被用于研究颅脑创伤，并已发现基于代谢组学的新型生物标志物。例如，CSF中溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)水平的升高反映其在颅脑创伤研究领域的潜在作用：LPA可增强血脑屏障的通透性进而导致脑水肿和出血，并可以诱导白细胞介素(interleukin，IL)-6等炎性细胞因子的产生[24]；LPA抗体可降低LPA对脑的神经毒性和促炎症作用，改善颅脑创伤小鼠的神经功能[24]。Abdullah等[25]采用基于LC-MS的代谢组学进行研究，发现小鼠颅脑创伤后3个月，海马体中卵磷脂、鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine，PE)均增加，而在皮质与小脑处减少；大脑皮层的卵磷脂及PE水平均高于小脑。卵磷脂、鞘磷脂及PE在颅脑创伤小鼠的不同脑叶中都具有其各自的区域特异性变化模式。

3.3 代谢组学在颅脑创伤患者中的应用 N-乙酰天冬氨酸(N-acetylaspartate，NAA)和乳酸盐可能是预测颅脑创伤患者短期临床结局的潜在生物标志物[26]。Barkhoudarian等[27]通过磁共振波谱分析技术探索中重度颅脑创伤后患者大脑代谢变化时发现，血清NAA/蛋氨酸比值与GCS评分呈正相关，与伤后3个月格拉斯哥预后量表(Glasgow Outcome Scale，GOS)评分呈负相关；血清乳酸/蛋氨酸比值与GCS评分呈负相关，与伤后3个月GOS评分呈正相关。乳酸是颅脑创伤后早期反映神经轴索损伤的生物标志物，可用于颅脑创伤严重程度和结局的预测；而NAA为神经元渗透代谢物、脂质和髓磷脂生物合成的前体，其并非颅脑创伤特异性生物标志物，肌萎缩侧索硬化症、多发性硬化症和血管性痴呆亦会引起NAA升高[28]。有学者采用磁共振氢谱技术检测颅脑创伤患者的CSF，发现其乳酸、丙二醇、谷氨酰胺及肌酐水平明显升高，而丙二醇与脑水肿密切相关，乳酸和丙二醇是氧代谢率、颅内压和GOS评分的强预测因子[29]。

代谢物-生物标志物检测亦有助于颅脑创伤严重程度分类。Jeter等[30]使用GC-MS和LC-MS比较健康者和颅脑创伤患者的血浆代谢物，结果显示，与健康者相比，重度颅脑创伤患者的血浆主要代谢产物如缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和特异性代谢产物异丁酰肉碱、3-甲基-2-氧代戊酸、丙酰肉碱和异戊酰肉碱水平均明显降低，甲基戊二酰肉碱水平也降低；与健康者相比，轻度颅脑创伤患者血浆缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸水平降低，而丙酰肉碱水平增加。这提示支链氨基酸代谢的改变可能影响颅脑创伤患者的能量代谢、蛋白质和神经递质合成。Jeter等[30]还发现，异亮氨酸和亮氨酸与颅内压升高(≥25 mmHg)密切相关，丙酸肉碱、2-甲基丁酰肉碱、4-甲基-2-氧代戊酸酯是颅内压升高的独立危险因子；而其采用非靶向LC-MS分析尿液代谢组学进行研究，发现有3 897项代谢指标有助于重度颅脑创伤的诊断。

Ottens等[31]应用串联质谱揭示了急性康复期后重度颅脑创伤患者的神经发育反应和康复进展的生物学机制。该研究提示基于尿液的代谢组学是一种无创、有效的连续采样纵向监测方式，对颅脑创伤分类具有潜在作用。Yi等[32]采用GC-MS技术对血清代谢物水平进行分析，发现中重度颅脑创伤患者与健康对照组血清中有20种代谢变化差异，其中存在认知障碍的中重度颅脑创伤患者血清丝氨酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺及花生四烯酸水平较健康对照组增加，丙酮酸、丙氨酸、谷氨酰胺水平较健康对照组降低(P<0.05)；无认知障碍的中重度颅脑创伤患者血清丝氨酸、苯丙氨酸、花生四烯酸和半乳糖水平较存在认知障碍的患者显著降低(P<0.05)。这说明颅脑创伤后的认知障碍与氨基酸代谢异常及脂质代谢改变有关，基于GC-MS技术的血清代谢物检测或可用于鉴别颅脑创伤后有无认知功能障碍。但上述研究纳入病例数较少，今后仍需大样本多中心研究予以验证。

3.4 挑战和技术限制 多发伤所致多种生物标志物升高可能显著降低颅脑创伤相关代谢物-生物标志物的特异性。理想的颅脑创伤相关代谢物-生物标志物应具有高敏感性、高特异性和高准确性，且具有低假阳性和低假阴性[33]，还不应受到如性别、年龄、体质指数和种族等因素的影响[34]，其应在颅脑创伤后迅速分泌至血液或高表达，可评估损伤程度、反映病理生理学状况并具有预后评估作用[35]。目前有关颅脑创伤相关代谢物-生物标志物的研究较少，仍需对代谢组学研究结果进行验证以提高其可重现性和可预测性。小样本量是低效研究的主要问题，通常出现低强度分析和过度拟合。小样本量与患者异质性的相结合可导致数据误解、预测能力降低和代谢标志物的选择不正确，因此错误发现率可能会增加[36]。因此，使用代谢变化的效应大小进行功效分析对估计样本量至关重要。此外，最常见的代谢组学分析手段如GC-MS、LC-MS均受基质效应、离子抑制和衍生化误差的影响，这些均是代谢组学实验准确性的潜在威胁。代谢变化对混杂因素(年龄、性别、体质指数、肠道微生物)和生活方式也非常敏感[37]。由于代谢物浓度将随时间变化，故采样时间对代谢组学分析影响也很大，因此要使用标准操作规程进行采样，以随机方式设置样品进行单次分析，以避免批次导致的影响。

4 总结与展望

颅脑创伤为高度异质性疾病，目前尚无高灵敏度和特异性的单一生物标志物用于颅脑创伤的诊断或预后评估。笔者认为代谢组学有以下的优势：可发现用于颅脑创伤患者诊断和预后评估的代谢物-生物标志物，这有助于揭示颅脑创伤潜在的病理生理学和神经生物学机制；高通量分析工具能够识别和量化数百种代谢物；此外，由于代谢物比蛋白质、RNA及基因更不容易被剪切，因此代谢组学也可能比基因组学和蛋白质组学更省时省力。随着个性化医疗的发展，代谢组学发现的生物标志物可促进患者个性化治疗的发展，并有助于通过药物代谢组学方法选择最佳的治疗策略。