赖氨酰氧化酶样蛋白2在肝纤维化及肝癌中的研究进展

冯 蕾 孙学华

(上海中医药大学附属曙光医院肝病科，上海市中医临床重点实验室，上海市 201203，电子邮箱：fenglei1121@126.com)

【提要】 赖氨酰氧化酶样蛋白2(LOXL2)是一种新的胺氧化酶，可催化胶原及弹性蛋白交联，其过表达将导致肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。大量研究表明LOXL2在肝纤维化和肝细胞癌肝脏细胞及组织中高表达，与肝纤维化的共价交联及肝癌细胞增殖、侵袭和转移密切相关，可作为一个良好的诊断指标和治疗靶点。本文就LOXL2与肝纤维化、肝癌的关系进行综述。

赖氨酰氧化酶样蛋白2(lysyl oxidase-like 2，LOXL2)于1997年因在正常衰老的人成纤维细胞中过度表达而被发现[1]，其为赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)家族成员之一。研究表明，抑制LOXL2的表达可以阻断胶原和弹性蛋白的交联，以减少各种细胞外基质的过度沉淀，被认为可以逆转肝纤维化。LOXL2的过表达还与肿瘤进展、转移、侵袭和肿瘤微环境的重构有关[2-3]。LOXL2可能成为未来肝纤维化及肝癌的治疗新靶点，本文就LOXL2与肝纤维化、肝癌的关系进行综述。

1 LOX家族与慢性肝病的关系

LOX家族是一种铜依赖性氨基酸氧化酶，具有保守的C末端结构域，可催化弹力蛋白和胶原纤维蛋白中赖氨酸残基ε-氨基基团氧化脱氨而产生肽基醛，形成催化胶原蛋白和弹力纤维的分子间共价交联，这种交叉连接将胶原蛋白和弹性蛋白的可溶性单体转变为细胞外基质中稳定性较强的不溶性纤维，交织成稳定的网状结构，发挥稳定细胞外基质的作用[4-5]。LOX基因家族共有5个成员，包括LOX，LOXL1，LOXL2，LOXL3，LOXL4[6]。Vadasz等[7]采用原位杂交和免疫组化方法将正常肝脏组织、威尔森氏病和原发性胆汁性肝硬化患者的肝脏组织进行石蜡包埋切片处理，发现在威尔森氏病和原发性胆汁性肝硬化病中LOX和LOXL2呈高表达，并与肝细胞内胶原沉积有关。Liu等[8]在四氯化碳诱导的C57BL/6J小鼠肝纤维化模型中使用LOX抑制剂β-氨基丙腈6周后发现，小鼠表现出肝纤维化加速逆转，同时LOX蛋白减弱了肝星状细胞的活化，而β-氨基丙腈是一种不可逆的LOX抑制剂，LOXL2的胺氧化酶活性不受β-氨基丙腈的抑制，这表明LOXL2的结构和亲和力与LOX不同。铜是LOX蛋白的辅助因子，它会导致肝脏的损伤和瘢痕。威尔森氏病作为一种铜代谢紊乱性疾病，会使肝细胞内LOX和LOXL2高表达从而导致进行性损伤肝脏[9]。目前研究表明LOX和LOXL2可促进纤维胶原Ⅰ的交联，而纤维胶原Ⅰ是纤维细胞间质和纤维化的主要组成部分；同时发现与LOXL2相比，LOX特异性药物(M64)对由丙型肝炎或脂肪性肝炎引起的肝纤维化缺乏有效性，使其在肝纤维化治疗期间的效果不显著[10]。

2 LOXL2的结构及功能

LOXL2是一种新的胺氧化酶，能够催化胶原蛋白和弹性蛋白形成赖氨酸从而衍生为共价交联[11]。胶原蛋白的聚合是器官纤维化的前提条件，研究表明，LOXL2被认为是肝纤维化的关键蛋白[12]。LOXL2的氨基酸序列由一个n端信号肽相连的774个残基组成，邻近n-末端4个清道夫受体富含半胱氨酸(scavenger receptor cysteine-rich，SRCR)结构域，SRCR结构域是具有110个残基的高度保守结构域，用于细胞信号的传导和黏附，重复的SRCR结构域通过与细胞外基质中的调节配体或蛋白质相互作用来调节LOXL2的胺氧化酶活性[11]。虽然从氨基酸序列中预测的LOXL2基因分子质量大约是84 kDa，但在最近一次研究中已经确定了一个较小的细胞外65 kDa形式的分子量[13]，其基因定位于8号染色体p21.2-p21.3，大多数LOXL2基因外显子-内含子交界处氨基酸序列为(C/T)AG-外显子-GT(A/G)，通过DNA序列分析，LOXL2与LOX有45%的同源性，与LOXL1有48%同源性[14]。研究发现，抑制LOXL1的活化对胶原蛋白影响不大，但可以有效减少弹力蛋白的交联，限制肝硬化的进展并抑制肝星状细胞的活化，在肝纤维化阶段LOXL2表达显著增加，表明LOXL2可能与肝纤维化有关[10，15-16]。Barker等[17]发现LOXL2诱导了生长在胶原基质上的成纤维细胞α-平滑肌肌动蛋白的表达，提示LOXL2通过参与局部黏着斑激酶/蛋白激酶B信号通路而激活成纤维细胞，激活的成纤维细胞可以表达更多的LOXL2，推动前馈循环，从而进一步促进癌症的进展。抑制LOXL2介导的成纤维细胞活化可减少肿瘤细胞的侵袭和转移，但不能减少原发性肿瘤细胞的生长。

3 LOXL2与肝病的关系

3.1 LOXL2与肝纤维化 肝纤维化是指慢性肝炎或肝损伤过度激活肝星状细胞转化为肌成纤维样细胞，最终导致细胞外基质的异常沉积是。肝纤维化进展为肝硬化将引起严重并发症，包括门脉高压、肝衰竭和肝细胞癌等，并导致较高的肝脏相关死亡率[18]。慢性肝病导致的肝纤维化是肝硬化的早期阶段,而且肝纤维化的临床症状常不够典型。流行病学调查结果显示，截至2015年，世界范围内约有2.57亿HBV携带者，88.7万人死于HBV导致的肝硬化；HCV携带者约7 100万人，39.9万人死于HCV导致的肝硬化[19]。肝纤维化主要是由肝脏的慢性炎症和趋化因子、细胞因子的活性变化而引起的免疫细胞(特别是巨噬细胞)的浸润和基质表达细胞类型的增加。最近的临床研究表明长期服用抑制HBV药物的患者，肝纤维化甚至肝硬化可发生逆转[20]。肝脏重塑瘢痕组织并且恢复到正常肝脏的能力遵循特定的机械原理，包括慢性组织损伤的终止、引发肌成纤维细胞凋亡或衰老、多余的瘢痕组织纤维蛋白溶解[21]。胶原交联是纤维化的基本过程，细胞外基质持续量化积累导致纤维化进一步发展，同时限制肝纤维化的逆转。肝纤维化的特点是细胞外基质蛋白沉积增多，造成组织过度瘢痕化，促进慢性肝损伤。而弹性蛋白降解的失败是肝硬化中细胞外基质积聚的重要因素[22]。肝星状细胞活化是肝纤维化发生过程中的关键[23]。近年来LOXL2在肝纤维化进程中的作用得到广泛的关注。Weiskirchen等[21]认为LOXL2抑制剂即单克隆抗体(AB0023)是非常有效的肝纤维化和肺纤维化靶向药物，LOXL2的表达受缺氧、转化生长因子-β和microRNA(microRNA-26和microRNA-29)的影响，同时此药正在进行丙肝、原发性硬化性胆管炎、非酒精性脂肪性肝炎相关的纤维化、肝硬化的2期临床试验。Ikenaga等[24]通过硫代乙酰胺诱导C57B1/6J小鼠肝纤维化模型，并采用特异性LOXL2单克隆抗体(AB0023)和特异性LOX单克隆抗体(M64)药物分别治疗6周，发现在AB0023治疗组中纤维间隔变薄、细纤维增多，而M64治疗组和安慰组则没有变化，但是AB0023治疗组早期干预时却不能有效抑制肝纤维化，而是对于晚期肝纤维化的作用比较突出，且在纤维间隔中体现显著优势；与安慰组比较，AB0023治疗组小鼠的交联胶原蛋白不溶解部分减少了45%，整体交联胶原蛋白减少20.8%。目前的研究已阐明，抗-LOXL2抗体加速硫代乙酰胺诱导的肝纤维化的逆转[21]。Dongiovanni等[25]在研究甲硫胆碱缺乏饮食的C57BL/6小鼠肝纤维化的发病机制时发现，胰岛素受体(InsR+/-)促进肝纤维化，使肝星状细胞转化受阻，患有2型糖尿病的非酒精性脂肪肝小鼠肝脏组织中LOXL2水平上调。这些实验表明，LOXL2在肝纤维化阶段呈现出高表达，并且能逆转肝纤维化。此外Meissner等[26]对18例因HCV、艾滋病毒或同时感染HCV及艾滋病毒的晚期肝纤维化或肝硬化的患者使用持续22周的LOXL2单克隆抗体(Simtuzumab)药物治疗，结果显示受试者耐受良好，且发现LOXL2单克隆抗体同时也会抑制金属蛋白酶-1和基质金属蛋白酶-9的活性，而金属蛋白酶对抗纤维化进程中胶原蛋白和细胞外基质的降解具有重要作用。Rosenbloom等[27]认为LOX和LOXL2为判断纤维化的发生和分期潜在的生物学标志物。

3.2 LOXL2与肝癌 据统计，2012年肝癌全球发病率为0.1‰,在中国肝癌位居第二大常见癌症，每年约有383 000人死于肝癌[28-29]。肝癌的发展是一个复杂的过程，涉及持续炎症损伤，包括肝细胞坏死和再生，且与纤维化沉积相关[29]。Wu等[30]通过细胞四唑盐比色法和5-溴脱氧尿嘧啶核苷细胞染色法对体外细胞培养进行检测，发现LOXL2对肝癌细胞株(SMMC-7721细胞和HepG2细胞)的增殖有影响，在HepG2细胞和SMMC-7721细胞中LOXL2 mRNA的表达水平显著上调，当两个细胞株感染LOXL2-siRNA时，LOXL2 mRNA的表达水平显著降低，沉默LOXL2基因将抑制HepG2和SMCC-7721细胞增殖、减少细胞集落形成，导致细胞周期阻滞，加速细胞的凋亡，表明LOXL2促进肝细胞癌的增殖，并且LOXL2在肝细胞癌细胞中高表达。Barry-Hamilton等[10]发现LOXL2 mRNA在大多数实体肿瘤中高表达且其水平上调与肿瘤分级的增加有关，并且增加肝癌转移的风险。Wong等[31]发现在肝细胞癌中缺氧诱导因子-1/SMAD4的激活使LOXL2水平显著增高和microRNA-26/29的失活，导致LOXL2的过度表达。LOXL2在肿瘤组织和肝癌患者的血清中均有表达，表明LOXL2可能是肝癌一个良好的诊断标志物。Wang等[32]将能稳定表达短发夹RNA的HepG2细胞和BEL-7402细胞对抗含有低氧模拟剂氯化钴的缺氧诱导因子-1后发现，低氯诱导因子-1α诱导LOXL2的上调，LOXL2高表达导致肿瘤进展和转移，促进肿瘤细胞的侵袭和肿瘤微环境的重构[33]。相关研究表明，通过抑制LOXL2表达可显著抑制肿瘤细胞的生长和转移，因此，LOXL2的高表达可作为肝癌的诊断依据及预后不良的评价指标，也可能为抗癌药物提供新的治疗靶点[34]。

4 展 望

LOXL2抗体可以抑制胶原蛋白交联，显著减少胶原沉积，而胶原蛋白和弹力蛋白是细胞外基质的主要成分，肝纤维化是细胞外基质的持续定量沉积的结果。LOXL2通过调节细胞信号通路参与纤维化及肿瘤的进展，抗肝纤维化及抗肝癌药物研究的主要目标是开发新的可靠的非侵入性方法，以取代纤维化或肿瘤评估中的肝脏活检[35]。然而在临床上仍存在诸多难题，如LOXL2抑制剂的毒副作用、疗效是否确切等。随着研究的深入，抑制LOXL2的活性可能是一种肝纤维化及肝细胞癌的有效治疗方向。