自噬在阿尔茨海默病中作用机制的研究进展▲

2019-03-18黄晓丹李兴锋陈业文

广西医学 2019年10期

吕燕吴林陈炜黄晓丹刘璐李兴锋陈业文

(1 广西中医药大学，南宁市 530001，电子邮箱：576781394@qq.com；2 广西中医药大学第一附属医院脑病一区，南宁市 530023)

【提要】自噬是机体通过吞噬作用将部分胞质、受损细胞器和功能障碍蛋白质等成分包裹形成自噬体，经溶酶体途径，消化包裹的内容物后获得营养与能量的过程，从而调控细胞内环境的动态平衡，以适应外环境的变化。多项研究表明，自噬在阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿舞蹈病等神经系统变性疾病的发生和发展中起着关键的作用。本文就近年来有关自噬在阿尔茨海默病中作用机制的研究进展进行综述。

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)又称老年性痴呆，是老年人常见的痴呆类型，属于神经退行性疾病。该病起病隐匿，呈持续性发展，主要表现为进行性的智能减退，最终导致患者完全丧失生活自理能力[1]。AD主要病理学特征为β淀粉样蛋白(amyloid β-peptide,Aβ)沉积形成老年斑和异常高度磷酸化的tau蛋白导致神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)，从而引起神经元及突触的功能异常[2]，其属于蛋白质异常折叠性疾病。自噬是细胞在机体内环境稳态发生改变或存在外界应激时，通过自噬溶酶体途径维持细胞的代谢平衡。研究表明,自噬功能障碍与由各种错误折叠蛋白聚集体引起的神经退行性疾病有关[3-4]。近年来，随着对AD研究的不断深入，人们发现自噬与AD的病理学特征密切相关[5]，自噬在AD发病中的作用机制越来越受到关注。现就自噬在AD中的作用机制做一综述。

1 自噬的概述

自噬是继细胞坏死及凋亡性程序性细胞死亡后的第三种细胞死亡方式。Porter与Ashford于1962年将胰高血糖素注入大鼠肝细胞后，细胞内出现了包裹有半消化的线粒体的某种致密体，他们把这种致密体的形成过程称为自噬[6]。随着研究的深入，自噬的相关基因(autophagy-associated gene，Atg)相继被发现，人们对自噬有进一步的了解根据细胞将物质运送至溶酶体内途径的不同，自噬分为3种类型：微自噬、巨自噬和分子伴侣介导所产生的自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)[7]。通常所说的自噬泛指巨自噬，其通过最终形成的自噬溶酶体降解内容物，维持细胞内代谢平衡。

1.1 自噬的形成及其相关基因自噬起始于内质网膜或高尔基复合体膜脱落形成的自噬泡，细胞内衰老或损伤的细胞器及变形或错误折叠的蛋白质被自噬泡包裹，逐渐延伸至将吞噬组分完全包绕隔离以形成自噬体，进而与溶酶体结合成自噬溶酶体，溶酶体内的酶类将被吞噬包裹的组分进行降解和循环利用，达到细胞本身代谢需要和受损细胞器的更新[8]。1997年，日本科学家克隆得到第一个酵母菌自噬基因，并将其命名为Atg1。此后人们相继从酵母、线虫、果蝇、高等脊柱动物的细胞中发现了类似同源基因[9]，并将此类基因命名为Atg，并在其后面加数字以区分不同基因[10]。目前已经确定的约40个自噬相关基因中，Atg1-Atg10、Atg12-Atg14、Atg16和Atg18这15个编码自噬蛋白的核心基因在哺乳动物中是保守的[11-12]，因此认为自噬在整个生物进化过程中是高度保守的细胞行为。

1.2 自噬的功能当细胞内环境发生变化或处于应激状态下时，细胞通过自噬溶酶体降解清除功能异常的蛋白、核酸、细胞及细胞器等大分子物质，重新为细胞提供能量与营养的原料，实现细胞内物质的循环及再利用，这个过程既是一种防御机制，又是一种应激调控，不仅能抵抗外来病原体的入侵，又能清除胞内代谢废物，保持胞体内环境的动态平衡。因此，当自噬功能障碍而导致自噬水平过高或过低时均会导致细胞的受损。

1.3 自噬的生物标志物检测自噬标志物可以动态、实时、定量地了解细胞内自噬的水平。目前，Beclin1、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，MAP1LC3)和p62蛋白常被用来评估机体自噬情况。

1.3.1 Beclin1：Beclin1是美国科学家Beth Levine克隆得到的第一个哺乳动物自噬基因，是酵母ATG6的同系物[13]。Beclin1主要定位在反面高尔基体、内质网和线粒体中，由450个氨基酸残基组成，分子量60×104。Beclin1可以与ClassⅢ磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)结合形成复合物来调节其他自噬相关基因蛋白，募集胞内的Atg5复合物(Atg12-Atg5-Atg16)和MAP1LC3，调节自噬的水平，且研究表明，自噬的活性随着Beclin1表达水平的上调而升高，而Beclin1基因主要通过与PI3K形成的复合体来调节自噬的活性，是调控自噬的重要正调节因子，在自噬体早期的形成中起着关键的作用[14-17]。因此，检测细胞内Beclin1表达水平可以评估自噬活性。

1.3.2 MAP1LC3：MAP1LC3是在高等真核细胞内发现的第1种自噬体膜蛋白，与酵母自噬相关蛋白Atg8为哺乳动物的同源物,主要作用于自噬体前体的延伸与闭环[18]。MAP1LC3分为Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型MAP1LC3主要存在于细胞质中，是自噬前MAP1LC3的表达形式[19]。细胞发生自噬时，新合成的MAP1LC3经过加工，形成可溶性Ⅰ型MAP1LC3。Ⅰ型MAP1LC3在自噬发生时经过泛素样化加工修饰后，与磷脂酰乙醇胺通过酶的级联反应结合形成Ⅰ型MAP1LC3，定位在膜结构的自噬体前体和自噬体中，是常用的自噬体标记性蛋白指示蛋白。膜结合型Ⅱ型MAP1LC3的含量可以反映细胞的自噬活性，Ⅱ型MAP1LC3与Ⅰ型MAP1LC3的比值与自噬泡形成的数量有关，常根据其比值或Ⅱ型MAP1LC3的表达水平判断细胞的自噬活性[20]。

1.3.3 p62：p62/SQSTM1(sequestosome 1)是一种具有多种功能的接头蛋白，是原癌基因c-myc编码的基因表达产物，其不仅是泛素蛋白酶体系统的一种蛋白，也是自噬溶酶体系统的蛋白[21]，对降解底物的识别和包裹起着至关重要的作用[22]。它既是自噬体与底物之间的适配子蛋白，本身又是自噬过程中选择性的底物之一。当自噬上游的表达增强或者下游的降解被阻断时，导致p62的聚集，进入成熟的自噬体内并被降解。在一些神经退行性疾病的细胞内，当自噬活性降低时，异常的蛋白质聚集体和包涵体中常发现p62，p62的表达水平与自噬活性呈负相关[23-24]。此外，p62通过与MAP1LC3连接参与自噬体的形成，最终在自噬系统中被降解，因此在研究自噬时可联合检测p62的表达水平及Ⅱ型MAP1LC3与Ⅰ型MAP1LC3的比值以评价自噬的水平[25]。

2 AD与自噬

2.1 AD的发病机制 AD的发病机制至今尚不明确，可能有多种因素参与，包括Aβ沉积、tau蛋白的过度磷酸化、自噬损伤、突触转导功能异常、线粒体功能障碍、炎性机制、氧化应激等[26-30]，其中比较公认的机制是Aβ的生成与清除失衡导致神经元变性和痴呆发生，以及过度磷酸化的tau蛋白影响神经元骨架微管蛋白的稳定性，导致NFTs的形成，进而破坏了神经元及突触的正常功能，从而导致AD的发生。有学者对AD患者的脑组织进行研究时发现神经元内存在大量的自噬体[31-33]，证明自噬在清除异常聚集的Aβ和高度磷酸化的tau蛋白的过程中起着关键的作用[34]，调控自噬的水平或可成为防治AD的一种新手段[35]。

2.2 Aβ与自噬 Aβ是在细胞外的α、β和γ分泌酶的先后作用下，级联剪切淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)产生的。有研究发现，自噬可以通过调节Aβ的生成和清除，抑制Aβ诱导的神经元细胞程序性凋亡，对抗Aβ对神经细胞的毒性作用，从而发挥保护神经功能[36]。Lucin等[37]研究发现，在双转基因痴呆小鼠模型的脑组织中Aβ沉积之前，其神经元细胞内自噬体已显著地增生、聚集。与正常小鼠相比，8～9周龄的双转基因痴呆小鼠的神经细胞自噬囊泡数目升高5倍，而9月龄的双转基因痴呆小鼠则升高23倍以上。采用APP转基因构建的AD小鼠模型实验显示，在AD早期Beclin1的表达水平降低，随着 Beclin1表达水平的减少，神经元细胞自噬程度减弱，细胞内外Aβ沉积增多[38-39]，提示自噬功能异常可影响Aβ的堆积。动物实验表明，在自噬缺陷的APP转基因杂交小鼠脑组织内，可观察到细胞外的Aβ显著减少，但细胞内Aβ却异常聚集、增加，提示Aβ在形成沉积斑块的过程中受自噬的调节[40]。有研究表明，自噬与口服疫苗诱导的Aβ清除密切相关，调节自噬通路可能是预防和干预AD的一个重要策略[41]。Aβ的异常沉积是AD发病机制中的一个关键环节，若能以自噬通路中的某些信号分子为靶点调节Aβ产生和清除的动态平衡，对AD防治具有重要的意义。

2.3 Tau蛋白与自噬 Tau蛋白是体内含量最高的微管相关蛋白，可降低微管蛋白分子的解离，促进微管的组装，维持神经元骨架微管蛋白的稳定性和轴突正常运输的作用[42]。在正常的脑组织中，与tau蛋白稳定结合的微管可以有效地介导自噬囊泡转运至溶酶体，以确保自噬的正常功能。而在AD患者脑组织中，可溶于水的异常磷酸化tau蛋白和异常修饰聚集成双股螺旋丝的tau蛋白比例明显增高，影响细胞的功能状态[43]。病理状态下的tau蛋白由于过度磷酸化形成NFTs，与微管结合的能力下降，失去了促进微管组装的生物学活性和维持微管稳定的特性[44-45]，致使自噬囊泡不能向溶酶体转运，而导致自噬功能障碍。研究表明，tau蛋白高度磷酸化后，其生物活性降低，导致轴突运输障碍及自噬囊泡的转运受阻，引起神经元轴突中的自噬体和营养不良的AD神经元突起数量增加，促进神经突起的炎性改变，神经元的正常功能遭到破坏[46]。冯利杰等[46]研究发现自噬缺陷的细胞中tau蛋白和磷酸化tau蛋白降解速率降低，提示自噬参与过表达tau蛋白和异常磷酸化tau蛋白的降解，抑制自噬活性可增加tau蛋白的细胞毒性。Kim等[47]发现高度磷酸化tau蛋白的清除有赖于核点蛋白52受体介导的自噬功能。使用自噬抑制剂氯喹、3-甲基腺嘌呤，或通过激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路抑制自噬时，tau蛋白磷酸化程度增高、AD相关的病理表现更为严重[7，48],而使用自噬诱导剂雷帕霉素后，自噬的活性增加，磷酸化的tau蛋白通过自噬系统被清除，AD的病理表现缓解[49-50]。以上研究均表明自噬在清除tau蛋白聚积的过程中扮演重要角色，当自噬功能异常，不能有效降解、清除异常磷酸化的tau蛋白，可引起NFTs，从而导致神经元及突触的功能异常，诱发AD的发病。