实时荧光定量PCR检测结直肠腺癌患者组织中广泛型线粒体肌酸激酶基因的表达

罗喜俊，何嘉琳，梁俊杰，朱显军，梁伟雄，唐兴奎

(广州市番禺中心医院消化中心二区，广东 广州 511400)

一般情况下，细胞内的能量缓冲以及能量转移系统则是由线粒体肌酸激酶(mitochondrial creatine kinase，MtCK)、细胞浆型的CK、Cr、PCr等共同组成的，也就是我们所说的CK/PCr循环，其对细胞和组织的代谢有着非常重要的影响[1]。在机体内，MtCK存在与线粒体膜上，其与胞浆型的脑型肌酸激酶(CK-BB)、肌型肌酸激酶(CK-MM)等一起被称为肌酸激酶同工酶家族，不但能够对三磷酸腺苷(ATP)与肌酸之间的高能磷酸键的可逆转移起到催化的作用，使得ATP含量增加，还参与了能量代谢和肌肉收缩的过程。根据亚型不同其又被分成了广泛亚型(uMtCK)和肌膜型亚型(sMtCK)。研究表明，肿瘤患者血清中uMtCK检出率较高，这也进一步说明了uMtCK的高表达与肿瘤高度的能量需求有着密切的关系[2]。本研究重点分析实时荧光定量PCR检测结直肠腺癌患者组织中uMtCK基因的表达情况。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年1月至2017年12月在我院治疗的98例结直肠腺癌患者作为研究对象，其中男58例，女40例；年龄37～77岁，平均年龄(58.52±2.14)岁；结肠癌36例、直肠癌62例。另选取同期100例健康体检者作为对照组，其中男53例，女47例；年龄36～75岁，平均年龄(57.39±2.09)岁。两组性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，均签署知情同意书且自愿参与研究。

1.2 方法

实时荧光定量PCR检测患者肿瘤组织及癌旁组织uMtCK mRNA的表达。(1)制备肿瘤组织细胞总RNA：将放在液氮中的肿瘤组织取出，提取其中的RNA，按照操作说明书严格的执行此项操作。通过琼脂糖凝胶电泳法，采用紫外分光光度仪对提取出来的RNA质量以及浓度进行检测，进而计算出RNA的含量。(2)制备定量阳性模板，以RNA为模板，采用RT-PCR法扩增出大小为208 bp的RNA序列，再将PCR产物进行回收纯化，与pMD18-T载体进行连接，将其转化后的结果接入到JMI109中，对PCR的阳性率进行鉴定，同时对其进行克隆和测序验证，最终得到人uMtCK片段的重组质粒pMD18-T-uMtCK。将重组质粒与GAPDH标准品以1∶10的比例进行稀释，并制作出各种浓度不同的模板[3]。(3)实时荧光定量PCR检测：取肿瘤组织和癌旁组织中总RNA不同的稀释度uMtCK阳性模板，将模板放在定量仪上进行扩增，此项操作所需要的反应体系以及反应条件均与上述相同。扩增反应结束后，采用计算机系统将本次得到的曲线与正常人的曲线进行对比，在此基础上结合内参得到各患者的uMtCK基因表达拷贝数。

1.3 统计学分析

应用SPSS 19.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，两组比较采用两独立样本t检验，计数资料以率(%)表示，采用χ2检验进行比较，P<0. 05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RNA的纯度和浓度

琼脂糖凝胶电泳结果显示18S、28S两条带，且后者的亮度约是前者的2倍，提示本次抽取的RNA比较完整。紫外分光光度仪结果显示，RNA的浓度为1.8～2.2。

2.2 RT-PCR扩增片段以及pMD18-T-uMtCK质粒的鉴定

以本次提取的肿瘤组织总RNA为模板，经测序后证明pMD18-T-uMtCK质粒序列与Genebank上的序列一致。

2.3 结直肠腺癌与健康者uMtCK mRNA比较

肿瘤组织中均存在uMtCK mRNA表达，其范围为7.5×105～5.3×108拷贝μgRNA，平均(9.2±5.8)×106拷贝μgRNA；癌旁组织中的uMtCK基因表达为4.4×103～6.8×105拷贝μgRNA，平均(8.5±3.2)×104拷贝μgRNA。上述结果均高于健康者，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

MtCK属于肌酸激酶家族成员，一般位于线粒体膜上，在线粒体呼吸、控制中有着重要意义[4、5]。当MtCK处于有氧状况，就会通过磷酸肌酸穿梭机制为肌肉收缩提供所需的能量，这也是保证细胞正常代谢的一种关键酶，从其分子形式上看，其与CK同工酶相同[6]。但是在氨基酸的组成，电泳性质、免疫性质等方面，其与CK同工酶却存在着较大的差异[7]。

正常人的血清中并不会出现MtCK的表达，但大多数恶性肿瘤患者血清中会出现uMtCK过表达。导致肿瘤患者血清中uMtCK过表达的原因可能是：(1)肿瘤细胞代谢速度的加快，也加快了肿瘤组织的增生速度，使得机体需要为其提供大量的能量，导致肿瘤细胞中uMtCK含量增加[8]；(2)肿瘤细胞在快速生长、快速增生，也在快速坏死，MtCK漏入到了血液循环中，增高了血液中MtCK的活性；(3)患者在经过大量的化疗药物治疗后，进而破坏了肿瘤细胞，使得一部分MtCK漏入在了血液中，导致血液中MtCK的活性增高[9]。

本研究结果显示，结直肠腺癌患者肿瘤组织中均存在uMtCK mRNA表达，其范围为7.5×105～5.3×108拷贝μgRNA，平均(9.2±5.8)×106拷贝μgRNA；癌旁组织中的uMtCK基因表达为4.4×103～6.8×105拷贝μgRNA，平均(8.5±3.2)×104拷贝μgRNA。上述结果均高于健康者，差异有统计学意义(P<0.05)。这也可能是由于肿瘤中需要高能量的转换，且通过凋亡并不能较好消除肿瘤细胞而造成的。

综上所述，结直肠腺癌uMtCK mRNA含量升高，这为提高临床诊断准确率提供了有价值的依据，实时荧光定量PCR检测结直肠腺癌uMtCK基因表达，其最终结果可采用绝对拷贝数表示，定量结果准确可靠[10]。