核酸适配体技术在胰腺癌诊断和治疗中的应用

戴碧纯，潘碧垚，张珊珊，庄伟伟，孙红光

（温州医科大学附属第一医院 精准医学中心，浙江 温州 325000）

1 核酸适配体简介

核酸适配体（aptamer）是通过指数富集的配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）筛选获得一段小ssDNA或者RNA序列。1990年，Tuerk和Gold[1]第一次从体外随机文库中筛选出对T4 DNA具有亲和力的序列，并创建了指数富集配体系统进化技术，并将该筛选技术称为“SELEX”。Ellington和Szostak等[2]从随机序列RNA文库中分离出可特异性结合多种有机染料的RNA序列，将其命名为aptamer。简单来讲，SELEX过程包括以下几个步骤：（1）设计、合成随机DNA或RNA文库；（2）与靶分子结合（通常包括正向筛选和负向筛选）；（3）靶分子与结合的aptamer分离；（4）分离得到的核酸适配体经PCR扩增，得到一个富集的核酸库；（5）经8～20轮筛选，核酸文库富集达到饱和，对该文库进行测序[3]。针对筛选的靶点不同，筛选技术包括有蛋白质SELEX[4]，Cell-SELEX[3]等。经过SELEX技术获得的适配体可折叠成特有的构象，如发夹结构、G-四聚体结构、环形结构等[5]，可与目标靶分子特异性结合，具有良好的靶标识别能力， 可与传统的抗体相媲美，又被称为化学抗体[3]。与传统抗体相比，aptamer具有分子质量较小，靶标广泛，免疫原性低或无免疫原性，生产成本低，易于化学修饰等优点。

2 核酸适配体用于胰腺癌早期诊断和治疗

胰腺癌（pancreatic adenocarcinoma，PAC）是一种恶性程度很高、诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤，约90%为起源于腺管上皮的导管腺癌。胰腺癌缺乏特异性的体征和症状，近年来其发病率和死亡率明显上升，或将超过乳腺癌、前列腺癌和直肠癌，成为继肺癌之后的第二大癌症[6]，胰腺癌的手术切除率较低，5年生存率约为5%[7]。目前临床上胰腺癌的早期筛查手段主要包括B超、CT、磁共振胰胆管成像（MRCP）、超声内镜（EUS）和经内镜逆行胰胆管造影（ERCP）等。CT 是胰腺成像检查的首选方式，也是术后评估胰腺癌复发的首选方法。然而CT诊断的敏感度随肿瘤直径的缩小而降低，且检查费用较高，限制了其作为无症状高风险人群的常规筛查项目[8]。血清肿瘤标志物的检查具有易于收集、创伤小、经济便捷等优点，目前临床上最常用的胰腺癌早期筛查的肿瘤标志物是血清糖抗原（CA19-9），其诊断胰腺癌的总体敏感度79%～81%，特异度80%～90%，但其阳性多见于进展期胰腺癌，对早期小胰腺癌的诊断效能低[9]。由于CA19-9在部分非恶性患者中会出现假阳性，如急慢性胰腺炎、梗阻性黄疸、肝硬化及胃肠道肿瘤，故主要用于判断胰腺癌分期、手术切除效率及检测术后复发[10]。目前认为单独检测CA19-9并不适用于早期胰腺癌尤其是小胰腺癌的检测及其与良性疾病的鉴别[11]。因此，提高胰腺癌的早期诊断率以及开发有效的PAC靶向治疗方法具有重要意义。

2.1 与胰腺癌细胞相关的适配体

癌症干细胞（CSCs）具有肿瘤诱导能力，与肿瘤转移，复发和化疗/放射抗性有一定的相关性[12]。因此，对CSCs的鉴定可能对胰腺癌的早期诊断有重要意义。Kim和Song[13]研究了胰腺CSCs相关适配体作为诊断和治疗药物的新工具。通过改良Cell-SELEX方法，筛选与胰腺癌中癌症干细胞结合的适配体。通过HPAC（胰腺癌细胞系）产生的tumor sphere进行正筛选，然后通过HPDEC（胰腺正常细胞系）进行负筛选。筛选出高特异性的适配体aptamer 1和aptamer 146，其KD值（平衡解离常数）分别为22.8 nmol/L和22.62 nmol/L。通过FACS（流式细胞荧光分选技术）分析与适配体阴性细胞相比，适配体阳性细胞显示出高表达水平的CSCs相关基因。通过共聚焦显微镜在适配体阳性细胞中也观察到CD44、CD24、ESA和CD133的共定位。在Kim和Song的研究中，这两种胰腺CSCs相关适配体可作为是新的肿瘤诊断标志物、CSCs靶向药物递送或循环肿瘤细胞检测的潜在候选者。

Dua P和Lee DK[14]基于Cell-SELEX筛选出核酸适配体aptamer SQ2，与胰腺癌细胞表达的ALPPL2（胎盘碱性磷酸酶蛋白）特异性结合。经修饰后，截短形式的适配体SQ2的长度为25个核苷酸，KD值为20 nmol/L，在5’和3’两端进行修饰或结合药物后不影响其靶向结合能力。实验证实aptamer SQ2可以通过网格蛋白运输或其他细胞内吞途径内化到胰腺癌细胞中，经化学修饰后可以用于靶向递送治疗性分子。Dua P和Lee DK[14]通过实验证实aptamer SQ2可以成功地将抗癌核苷类药物5F-dU（5-氟-2’-脱氧尿苷）递送至表达ALPPL2的胰腺癌细胞中，但对正常胰腺导管细胞没有细胞毒性。

2.2 核酸适配体偶联药物（ApDCs）在胰腺癌治疗中的应用

吉西他滨（Gemcitabine）为一种新的胞嘧啶核苷衍生物，进入人体内后由脱氧胞嘧啶激酶活化，由胞嘧啶核苷脱氨酶代谢，是嘧啶类抗肿瘤药物。其作用机制和阿糖胞苷相同，主要作用于G1/S期，抑制核苷酸还原酶，导致细胞内脱氧核苷三磷酸酯减少，可抑制脱氧胞嘧啶脱氨酶，减少细胞内代谢物的降解，具有自我增效的作用。吉西他滨目前被认为是治疗胰腺癌的一线化疗药物，具有分子量小，亲水性高等优点，同时也存在反应效率低，易被胞苷脱氨酶降解，细胞渗透性差等缺点。

AS1411是一种富含鸟嘌呤核苷酸的DNA适配体，可以形成G-四链体这一独特的结构，使得结构相对于其他适配体相对稳定。aptamer-AS1411已被证明对许多癌症具有抗癌作用。核仁素（nucleolin）是一种细胞质膜蛋白，通常过表达于PAC等多种肿瘤细胞膜及其细胞质中[15]，AS1411可与核仁素特异性结合，高剂量AS1411与核仁素结合可以抑制NF-κB信号通路，导致细胞周期停滞和细胞凋亡[16]。因此，Bates[17]开始对AS1411进行一些临床研究。然而，AS1411的II期临床试验结果不足以成为一线治疗药物。

Park等[18]研究了适配体-药物偶联物（ApDCs），以试图克服它们的细胞渗透性差，非特异性毒性等缺点，与抗体偶联药物相比，ApDCs在偶联、制剂等方面比抗体有优势。Ray等[19]首次报道了将吉西他滨掺入寡核苷酸的概念，通过突变RNA聚合酶将吉西他滨掺入寡核苷酸中，并将含吉西他滨的寡核苷酸进行靶向药物递送。Park等[18]开发了一种掺入吉西他滨的AS1411，即APTA-12。吉西他滨是一类可以掺入寡核苷酸的核苷脱氧胞苷类似物，AS1411可形成稳定的G-四链体结构，内部茎环结构位于12-15个核苷酸之间（序列为5’-GGTGGTGGTGGTTGTGG TGGTGGTGG-3’）。通过用吉西他滨亚磷酰胺单独取代AS1411序列14位的鸟嘌呤残基，产生了APTA-12适配体。APTA-12适配体的序列是5’-GGTGGTGGTG GTTZTGGTGGTGGTGG-3’（Z，吉西他滨）。Park将吉西他滨掺入AS1411适配体的茎环区域，以避免改变三级结构并保护其免受核酸酶的快速降解。实验测定了APTA-12和AS1411的KD值，分别为（14.37±8.93）nmol/L，和（16.36±10.30）nmol/L。该结果证明AS1411序列的环区域的吉西他滨修饰不改变结合亲和力，并且化学修饰的APTA-12保留了比AS1411适配体对核仁蛋白稍高的结合亲和力。

APTA-12在Capan-1，AsPC-1和MIA PaCa-2细胞的共聚焦实验中，选择性地结合到细胞表面，叠层成像显示内化的APTA-12适配体仅在核仁蛋白阳性细胞中积累。而流式细胞术分析表明APTA-12适配体与核仁蛋白的亲和力比AS1411更高。此外，APTA-12处理胰腺癌细胞后显著降低细胞增殖，APTA-12处理细胞的IC50（半抑制浓度）值远低于AS1411。体内评价显示APTA-12可有效抑制裸鼠胰腺癌细胞的生长。与AS1411处理的小鼠相比，APTA-12处理的小鼠的肿瘤区域中的FDG SUV降低了78%，治疗组之间体重没有明显差异。TUNEL检测和Ki67测定显示，与对照组相比，APTA-12能够诱导更多的凋亡细胞死亡并减少增殖的肿瘤细胞的数量。实验结果证明掺入吉西他滨的APTA-12的具有抗肿瘤的功效。

Yoon等[20]合成了吉西他滨掺入5-氟尿嘧啶的RNA适配体，并证实了它可被内化并抑制了胰腺癌细胞的增殖。将溶瘤核苷类似物内在地掺入适配体被证实可能是开发ApDCs的良好策略，因为其易于化学修饰同时不损失亲和力，便于大规模化学合成，在体内比单独的药物具有更高的治疗效果，是目前比较有前景的一种抗癌策略。

胰腺癌由于其肿瘤基质中细胞外基质（ECM）的异常表达，形成紧密的物理屏障，导致细胞毒性化学治疗剂难以递送至肿瘤细胞中[21]。尽管已经开发了纳米药物，例如脂质体、聚合物纳米颗粒和胶束，以增强化学抗癌剂的渗透性[22]，但治疗效果仍不理想。HE[23]基于适配体GBI-10设计了具有肿瘤穿透和智能药物释放曲线的Apt/CPP-CPTD NP（适配体/细胞穿透肽-喜树碱前药）。GBI-10适配体靶向ECM，被修饰到可渗透细胞的穿透肽（CPP）上，用于体内CPP伪装和PDAC归巢，增强了PDAC靶向药物递送，并且降低了药物的全身毒性。

3 核酸适配体在胰腺癌应用中面临的问题及展望

核酸适配体的发展为肿瘤的诊断和肿瘤靶向治疗提供了一种新的方法，与现有的血清学肿瘤标志物检查相比，针对胰腺肿瘤标志物筛选出的核酸适配体兼具敏感性和特异性，再结合影像学检查结果，对提高胰腺癌早期诊断有一定的帮助。核酸适配体具有良好的组织穿透能力，易被细胞内化，与胰腺癌治疗药物偶联可靶向肿瘤特定位点，起到靶向治疗的作用，降低一些化学药物的全身毒性。靶向PAC 细胞的适配体还可以被开发成传感器，用于快速、高效和更加灵敏地检测PAC。

但核酸适配体还存在着一些问题：（1）适配体在体内稳定性较差，体外筛选得到的适配体在体内易被核酸酶降解[24]；（2）适配体相对分子质量小，易被肾脏快速过滤。由于这些缺点，限制了核酸适配体在PAC的临床应用。为了推动适配体在PAC临床应用的发展，主要可从以下几个方面来解决上述问题：（1）通过化学修饰，添加2’-氟、2’-氨基、或2’-O-甲氧[25]，提高核酸适配体的核酸酶抗性；（2）筛选具有稳定结构的适配体，如G-四聚体以提高生理环境中的核酸适配体的稳定性；（3）与大分子生物材料偶联可以解决核酸适配体易被肾脏过滤清除的问题，如偶联纳米材料[26]。上述修饰或改构方法均可显著提高核酸适配体在体内应用的有效性，随着研究的深入，核酸适配体有望应用于胰腺癌早期诊断和/或靶向治疗，为这一难治性肿瘤的临床诊断和治疗提供新的思路。