肺炎克雷伯菌疫苗研究进展

沈自燕 冯旰珠

南京医科大学第二附属医院呼吸科210011

1882年Carl Friedlander首次从肺炎死亡患者的肺中提取并描述了肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia，KP)[1]。KP是一种革兰阴性杆菌，属于肠杆菌科，广泛存在于自然界中。KP兼性厌氧，无鞭毛及芽孢，可有荚膜，营养要求不高，在普通培养基上生长的菌落大，呈黏液状，以接种环挑之易拉成丝，此特征有助于鉴别。根据其毒力及致病特点，KP可分为普通肺炎克雷伯菌(classic Klebsiella pneumonia，c KP)和高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulent Klebsiella pneumonia，hv KP)，其中hv KP因其高黏液性更易引起健康人群及青年人群患病[2]。有研究发现，hv KP主要引起社区获得性肝脓肿、脑膜炎、重症肺炎、眼内炎等，也可以形成多远处播散[3]，造成这种现象的具体原因及机制尚不清楚，尚有待人们去探索研究。

如所周知，KP可引起多种感染，如肺部感染、尿路感染、腹腔感染、手术部位感染甚至血流感染等，而在有严重基础疾病及免疫功能低下患者其更易罹患该病原菌感染的发生；在感染科室分布中，包括新生儿病房、ICU、老年病房、泌尿科病房等，ICU则是KP感染发生的重点临床科室，在ICU革兰阴性菌感染中，其占15%左右[4-5]。研究发现，KP在导致革兰阴性菌血症及尿路感染的病原菌中位列第二，更是引起医院呼吸道感染的最常见病原菌[6]。KP的病死率极高，据统计KP引起血流感染的病死率为20%～30%，总的人群死亡率为1.3/10万，而KP菌血症同时合并肺炎的病死率可达50%以上[1]。

目前，随着临床中广谱抗生素的大量不合理运用，KP对抗生素耐药性不断增加。2018年一项关于KP耐药的流行病学研究显示：KP分离株对氨曲南和头孢他啶的耐药率分别达到了55.4%和55.7%[7]。KP的耐药机制复杂多样，包括产β-内酰胺酶、氨基糖苷钝化酶、染色体变异、质粒及整合子介导、外膜孔蛋白缺失、靶位改变、生物膜形成及主动外排机制等[8-10]。随着KP感染在临床感染中所占的比例不断增加，人们在研究新的治疗方案或新型有效药物控制感染的同时，也在努力把目光投向免疫治疗。很多学者开始尝试利用KP全菌、核糖体、外膜蛋白、荚膜多糖、脂多糖等KP不同结构的免疫原性，诱导机体产生抗KP免疫，从而达到预防或控制KP感染的目的。本文就KP疫苗研究进展综述如下。

1 KP灭活全菌疫苗(inactivated whole cell,IWC)

IWC是运用物理加热或者福尔马林、甲醛等化学物质灭活病原微生物，然后以灭活的病原菌诱导机体免疫应答，从而达到预防感染的目的。IWC由于病原菌本身的部分结构的内毒性及安全性问题，目前尚未运用于临床。2013年Sun等[11]制备了KP灭活全菌疫苗，但研究发现KP携带的sit A蛋白对细胞存在明显的毒性作用，sit A是在肠杆菌科细菌转运其自身营养代谢相关的亚铁与锰离子的一种调节转运蛋白基因，其表达水平随着细菌培养条件的变化而改变。研究中，Sun等[11]运用基因工程技术并通过体内和体外实验证明，sit A的缺失将减弱KP菌的毒性。他们用紫外线灭活sit A缺失菌株和野生菌株，然后将其注射入小鼠腹腔内，两周后用相同剂量野生型菌株经腹腔感染小鼠，结果显示所有注射了sit A缺失菌株的小鼠存活，而对照组存活率则为80%，且其差异有统计学意义。该研究结果表明，sit A缺失菌株灭活菌能够有效诱导小鼠免疫功能，既能保留其良好的免疫原性，同时又剔除了sit A的毒性，因此敲除sit A构建KP菌的无毒株全菌疫苗，进行更深入的研究很有必要。此外，除了IWC外，另一种相对安全的技术则是采用细菌细胞的完全裂解物方法，制作含有所有细胞组分的非细胞疫苗。然而，KP的细胞裂解物可引起接种部位严重局部反应，常常导致皮肤组织坏死，严重时甚至可引起过敏性休克[12]。这种现象表明，KP裂解物中含有多种对机体有害的毒性成份，简单裂解而不加以选择性剔除，则不能运用到机体进行诱导免疫，但KP菌体成份复杂、各种蛋白结构种类繁多，选择性剔除研究工作会庞大而漫长。因此，近年来这方面的相关研究相对较少。

2 核糖体疫苗(ribosomal vaccine)

核糖体是一个巨大的核糖核蛋白体，其功能是将m RNA转译成多肽，同时也是主要的抗生素靶点。核糖体疫苗主要由非细胞壁成分组成，其中主要为细胞溶质成分。1978年人类首次尝试研制KP核糖体疫苗，并在104名健康男性中以气雾剂形式进行接种，研究结果示试验组较对照组特异性抗体增加明显，且差异有统计学意义[13]。然而，随后的一系列研究发现，核糖体疫苗具有保护作用是由于受细胞壁成分的污染，而并来自于非核糖体制剂本身的免疫作用，纯化的核糖体制剂不具有免疫原性来对抗KP感染[14-15]。因此，普遍认为KP核糖体疫苗开发前途不大。

3 外膜囊泡(extracellular vesicles,EVs)疫苗

革兰阴性菌衍生的细胞外囊泡，也称为EVs，是直径为20～200 nm的球形双层磷脂，主要由外膜蛋白、脂多糖、外膜脂质、周质蛋白及其他与部分毒力蛋白物质组成。2015年Lee等[16]首次研究发现KP的细胞外囊泡能够对KP感染中起到抵抗作用。他们通过鼠脓毒症模型验证，接种KP外膜囊泡能诱导体液免疫与细胞免疫，从而降低小鼠死亡率。因此，开发EVs用于制备KP疫苗不失为一个颇有前途的策略。但是，EVs成分同样也很复杂，而其具体作用机制及对宿主细胞的毒性作用尚仍有待深入研究。

4 蛋白疫苗(protein based vaccine)

KP的免疫原性蛋白主要包括KP细菌的细胞表面蛋白和一些毒力因子，其中细胞表面蛋白主要包括外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)和菌毛蛋白(fimbriae proteins)[14]。鉴于毒力因子改造的复杂性，本文仅就对三种蛋白疫苗进展进行介绍。

4.1 KP细胞毒素(Klebsiella cytotoxins，KCTs)KCTs是致病KP的重要毒力因子，在宿主应激状态下表达更高。早在2001年Singh和Sharma[12]观察了粗制细胞毒素(多黏菌素B提取物，polymyxin-B extract，PBE)及纯化的KCTs(KCT-Ⅰ、KCT-Ⅱ和KCT-Ⅲ三种类型)制备的类毒素疫苗对兔和小鼠KP感染的保护效力。研究发现，KCT-I和PBE制成的类毒素在兔和小鼠感染KP后可起到保护作用；有趣的是，接受免疫的雌性兔可将母乳的保护性免疫球蛋白传递给子代，且对子代的抗感染保护作用能保持1个月以上。该研究结果提示，类毒素疫苗可以用于保护实验动物及其后代对抗KP感染，至于能否应用于人体，尚待更深入研究。

4.2 OMP OMP是一类存在于细菌外膜的蛋白，其具有稳定细菌外膜结构并参与营养物质代谢，还具有调控一些小分子物质如抗生素进出细菌的作用。2010年Kurupati等[17]首次评估了表达OMP的DNA疫苗的免疫原性，并确定其具有对抗KP感染的保护作用。研究发现，构建的Omp A和Omp K36基因质粒在接种小鼠中后，可诱导相应抗体的产生、并促进TH1细胞介导的免疫应答，在一定程度上保护小鼠免受KP的攻击。因此，研究者认为可以积极开发KP菌Omp A和Omp K36的DNA疫苗应用于保护人类的研究；另有Babu等[6]于2017年用免疫显性抗原Omp A和Omp K36制成重组蛋白(AK36)，并在小鼠模型中评估重组多表位亚基疫苗(r-AK36)的安全性和保护效力。研究结果显示，与对照组相比，重组抗原可刺激实验组小鼠脾细胞增殖达三倍之多。当用3×LD100(100%致死剂量)剂量KP菌攻击r-AK36免疫的小鼠时，约80%的小鼠在观察期之后存活，r-AK36促进免疫小鼠产生保护性细胞因子IL-2和IFN-γ。该研究结果表明，r-AK36能够有效抵抗KP菌的感染，而鉴于外膜蛋白Omp A和Omp K36在KP菌株中的高度保守性，可以为不同菌株的KP菌感染提供广泛的保护作用。

2018年Husseina等[18]在小鼠感染模型中评估了两种OMP(Omp K17和Ompk36)及其融合蛋白(F36/17)对KP菌攻击的免疫保护作用，该研究中运用并比较了3种不同的免疫佐剂：GEM(Gram-positive enhancer matrix)佐剂、Hz(synthetic hemozoin)佐剂及不完全弗氏佐剂(incomplete Freund's adjuvant，IFA)。其中，GEM佐剂是由乳酸乳球菌经热酸处理后形成的细菌样颗粒，主要由肽聚糖结构细胞壁组成，缺乏如DNA等胞内物质；Hz佐剂则是疟原虫分解血红蛋白形成的副产物；弗氏佐剂包括完全弗氏佐剂及不完全弗氏佐剂(主要由热灭活的结核分枝杆菌、石蜡油和羊毛脂混合而成，主要诱导Th2细胞免疫应答)。该研究中，Husseina首先运用基因重组技术表达、纯化上述3种蛋白，然后分别用上述3种免疫佐剂分别与重组蛋白抗原免疫小鼠3次(分别在第1、14、28 d免疫)，在第3次免疫后的两周，以致死剂量的KP菌攻击小鼠，最后评估免疫保护效应。结果显示，Omp K17、Ompk36及F36/17 3组小鼠存活率分别为50%、60%及50%，且3种免疫佐剂中IFA组显示了较为良好的保护作用。该研究结果表明，Omp K17或Ompk36都具有良好的开发前景，而两种OMP的融合没有显示更强的免疫原性。

4.3 菌毛蛋白 菌毛的主要物质成分是菌毛蛋白，该类蛋白由相关的基因编码表达。KP菌毛主要介导该菌接近或吸附宿主细胞黏膜。KP存在多种菌毛，但以Ⅰ型和Ⅲ型菌毛为主。研究发现，KP菌的Ⅰ型菌口可以与宿主细胞糖蛋口中的甘露糖结合，Ⅲ型菌毛则具有抵抗甘露糖血凝的特性。菌毛蛋白在与宿主细胞作用的过程中能被宿主免疫系统广泛识别，从而诱导机体免疫。早在2005年Lavender等[19]就观察到，Ⅲ型菌毛蛋白能够诱导小鼠产生高滴度抗体以抵抗KP菌在呼吸道的攻击效应。人们通过对菌毛的结构研究发现，Ⅲ型菌口表达及调控基因包括mrk A和mrkD，其中mrk A是Ⅲ型菌毛的编码基因簇，而mrk D则是调节基因簇，Mrk A蛋白主要与细菌附着宿主细胞及形成生物膜有关，且Mrk A广泛存在于KP菌中，具有高度保守性。2016年Wang等[20]研究发现，抗Mrk A抗体在体外可减少KP生物膜的形成，并能在小鼠KP肺炎模型中发挥保护作用；Wang等[21]的后续研究进一步对Mrk A的结构进行了探究，认为Mrk A有望成为对抗KP菌的重要免疫靶点。鉴于蛋白疫苗的生产成本相对较高，可以考虑将外膜蛋白及菌毛蛋白等用作载体蛋白。

5 多糖疫苗(polysaccharide vaccine)

细菌中存在多种糖类物质，其中由于荚膜多糖(capsular polysaccharides，CPS)和脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)的O-多糖具有免疫原性，人们将其制成多糖疫苗，并尝试用于对抗KP感染。多糖疫苗主要是由特异性的多糖纯化后制成。

5.1 荚膜多糖疫苗(capsular polysaccharide vaccine) 荚膜多糖位于KP细胞最外层，是KP的重要毒力因子。由于荚膜多糖结构差异较大，目前荚膜多糖主要已鉴定出79种血清型，其中K1和K2血清型与hv KP有关[3，22]。研究发现，荚膜多糖在人类KP感染的发病机制中发挥重要作用。2017年Seeberger等[23]从荚膜多糖及相关序列中合成了名为CRM197-1的半合成疫苗，研究发现CRM197-1疫苗在小鼠和兔子中可产生高滴度抗体，该抗体可与天然荚膜多糖交叉反应，且CRM197-1疫苗还可通过介导吞噬细胞的吞噬作用对抗耐碳青霉烯类KP菌。至于CRM197-1在动物感染模型中的免疫保护效应评估及免疫保护机制目前仍有待进一步研究。然而，由于荚膜多糖有血清型的多样性，单价荚膜多糖疫苗不能提供对KP菌的广泛保护效应，因而在很大程度上限制了KP荚膜多糖疫苗的开发应用。

5.2 脂多糖疫苗(lipo-polysaccharide vaccine) LPS是革兰阴性菌表面的主要脂质及其细胞壁的主要成分。LPS主要包括三个结构区域：脂质A链、寡糖核心和O-多糖重复的外部区域，其中脂质A是主要的内毒素因子。LPS的O抗原能干扰巨噬细胞和中性粒细胞的吞噬作用以及细胞因子的产生[24]。目前由于脂多糖O抗原的不同，脂多糖分为9种血清型，其中O1、O2、O3血清型在感染中占绝大部分，文献报道达80%[22，25]。Clements等[26]研究证实纯化的LPS可以诱导小鼠产生抗KP感染的免疫保护作用，且O抗原特异性抗体可用于治疗或预防KP感染。Jain等[27]运用热酚提取法从KP中提取LPS抗原成份，采用乳液离子凝胶化法制备包被LPS的海藻酸钠微粒，在瑞士白化小鼠分别经由肌内、气管内和鼻内三种免疫途径比较游离LPS和包被LPS在体内的免疫原性，结果发现气管内途径接种，包被LPS比游离LPS显示出更强的免疫原性。其他多项研究也证明了LPS较强的免疫原性，且这种免疫原性其与其他革兰阴性杆菌能共享交叉反应，从而显示其作为候选疫苗的优势。需要指出的是，LPS疫苗主动免疫的明显缺点则是其不良的内毒素反应，但通过酸或碱性水解或与脂质体结合则可降低这种内毒素毒性。

6 结合疫苗(conjugate vaccine)

结合疫苗是运用化学方法将多糖抗原共价结合到载体蛋白上形成糖蛋白，从而达到持久的免疫保护效应。最先报道的KP结合疫苗，是将2个单位的重复四糖(八糖抗原)偶联到牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)和钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)上，研究结果显示两种混合物都产生了胸腺依赖性抗原[28]。早在2002年，Libon等[29]尝试将荚膜多糖与P40(KP重组外膜蛋白A，具有良好的抗原载体性质，是多肽和多糖的载体分子[30])结合制成疫苗，结果发现结合后荚膜多糖的免疫原性明显增强。因此，研究者推测，具有T-辅助表位的P40有利于同源B-T细胞间的相互作用；Ahmad等[31]则于2012年构建了O-抗原与外膜蛋白结合的结合疫苗，并对其结构的稳定性、安全性以及对尿路感染、肺部感染及血流感染的免疫保护作用进行了观察，发现这种其诱导的免疫保护作用可以通过胎盘传递给疫苗接种的实验兔模型子代，表明这种结合疫苗具有持久的免疫原性。由于目前载体蛋白种类单一且生产成本较高，在一定程度上限制了结合疫苗的发展。

7 反向疫苗(reverse vaccine,RV)

反向疫苗学是通过对某一病原体基因组测序分析，筛选出抗原决定簇，并对这些抗原决定簇进行高通量克隆、表达、纯化，得到重组蛋白，并对候选抗原进行体内、体外评价，从而筛选出保护性抗原，并运用于疫苗的研制。与传统疫苗研究方法相比，RV更加便捷、宽泛、安全。目前反向疫苗学越来越广泛运用到各种病原微生物的疫苗研究中[32]。Lundberg等[33]于2013年从100例临床诊断为KP感染(其中包括皮肤或软组织感染、肺炎、败血症、腹腔内感染和尿路感染)个体及89名健康个体的血清中进行全基因组抗原选择，运用抗原组学(Antigenome)技术筛选出KP的169种抗原蛋白，包括已知的保护性抗原Fep A。然后通过体外分析和鼠科感染模型，确定了8种能够诱导主动免疫提供保护作用的新蛋白，这8种新蛋白有望用于KP疫苗的制备。反向疫苗学开辟了一条新的疫苗研制途径，有助于预测和发现以往未知的免疫原，在今后疫苗发展中将发挥越来越重要的作用。

8 展望

KP是自然界中的常见细菌，同时也是最常见的机会性致病菌之一。近年来，随着高效广谱抗菌药物的广泛使用，KP的耐药性不断增加，已成为世界公共卫生的一大难题，利用疫苗预防和控制KP感染成为一种新的策略。目前众多研究表明：灭活全菌、核糖体、EVs、蛋白、多糖等具有良好的免疫原性和抗原性，但各有其优缺点。随着基因组学和生物信息学技术的不断成熟，RV也开始应用于疫苗的研制开发，随着对KP基因组成及致病机制的不断研究及分子生物学的不断发展，终有一日KP疫苗应用于临床不再是设想。

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