Pig-a基因突变试验研究进展

陈高峰，王亚楠，王 丹，毛志慧，黄芝瑛，文海若，*，王 雪，*

(1.中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心，药物非临床安全性研究北京市重点实验室，北京 100176；2.中山大学药学院，广东 广州 510006)

体内试验能够较好地模拟药物在机体吸收、分布、代谢、排泄并产生毒性作用的全过程，是药物临床前研究用以评价潜在遗传毒性的重要手段。2011年修订的人用药品注册技术要求国际协调会议(The International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use，ICH)遗传毒性试验指导原则S2(R1)[1]在原有的标准试验组合基础上增加了第2种选择，即提供了不进行体外哺乳动物细胞试验而直接开展体内遗传毒性试验的可能，同时，建议在可行的条件下将多个终点的遗传毒性研究整合至一般毒性研究中，以符合动物试验“3R”原则。这无疑是对体内遗传毒性检测方法提出了更高的要求，而目前被采纳的体内试验方法主要检测染色体结构变化和DNA损伤。因此，亟需开发快速、简便和实用的体内基因突变试验方法，以满足受试物遗传毒性评价的需求。近年建立的Pig-a基因突变试验作为新的体内遗传毒性检测方法得到了快速发展，该方法快速简便，使用普通动物即可开展试验，因此具有良好的实用性。

1 Pig-a基因突变试验原理

人的磷脂酰肌醇聚糖A类基因(phosphatidylinositol glycan class A gene)，简称PIG-A基因(啮齿类动物同源基因为Pig-a基因)，于1999年被Iida等[2]从人类基因组中成功分离。PIG-A基因位于X染色体上，在人和不同动物物种间具有高度保守性。该基因的单一突变即可导致糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidyl inositol，GPI)锚无法正常合成，GPI的一端为磷脂结构，其脂肪酸链位于细胞膜内，起连接固定作用；另一端为异质性短分支多糖，延伸至细胞间隙，连接不同类型蛋白质后构成细胞表型[36]。许多细胞表面分化抗原，如CD48、CD55以及CD59等，正是通过GPI锚连接在细胞膜表面形成不同细胞表型而发挥生物效应，所以当GPI锚无法正常合成时，造成细胞GPI锚链蛋白缺失。PIG-A基因突变的大多数研究源于一种称为人阵发性睡眠性血红蛋白尿症(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH)的临床疾病，PNH为罕见的由相当大部分骨髓干细胞PIG-A基因突变所导致的获得性遗传损伤疾病[3]。由于骨髓干细胞为整个造血系统的先导，PIG-A基因突变会影响着许多细胞系的功能，包括红细胞、粒细胞、单核细胞以及淋巴细胞等。PIG-A基因的突变间接地导致这些细胞表面GPI锚链蛋白的缺失，而一些GPI锚链蛋白已得到广泛的研究，特别是CD55和CD59。

据Kawagoe等[4]报道，Pig-a基因的结构、位点和功能在不同动物种属中均具有高度保守性，这也为在不同物种间建立体内Pig-a突变检测方法提供了可能。Pig-a基因在小鼠中，与人的同源性为88%，在核心区域的同源性为94.5%。Pig-a基因编码N-乙酰葡萄糖胺转移酶复合物的催化亚基，参与GPI锚的早期生物合成。在合成GPI的整个过程中所涉及的基因包括Pig-a基因在内至少有12个。然而，只有Pig-a基因位于X染色体上，其他基因(如Pig-b和Pig-c等)均位于常染色体上[5]。由于在常染色体上两个等位基因同时发生突变而导致GPI锚缺陷的事件非常罕见，而位于X染色体上Pig-a基因的单一突变即可使GPI锚无法表达，因此，GPI锚缺陷表型等同Pig-a基因突变，从而可通过检测细胞表面GPI锚链蛋白来得知Pig-a基因突变的情况。该试验方法具有较长的检测窗，允许在试验过程中重复采集样本，能够无创、持续、动态地监测动物体内的突变反应，因而可较容易地整合至重复给药毒性研究中，是极具发展前景的体内基因突变检测方法。因此，可通过检测细胞表面GPI锚链蛋白的缺失情况，以Pig-a基因突变率的变化来评价受试物的遗传毒性。

2 Pig-a基因突变试验的建立

1999年，Araten等[6]建议建立以Pig-a基因为报告基因的体内基因突变试验方法；2008年，Bryce和Miura等[7-9]首次正式报道以此试验方法开展临床前遗传毒性研究，试验以SD大鼠为受试对象，每隔1 d腹腔注射N-乙基-N-亚硝基脲(N-ethyl-N-nitrosourea，ENU)或灌胃给予7,12-二甲基苯并[a]蒽(7,12-dimethylbenz[a]anthracene，DMBA)3次，以外周血红细胞表面CD59的缺失率作为Pig-a基因突变的检测终点，以噻唑橙作为核酸染料区分正染红细胞与网织红细胞，利用流式细胞仪分析这两种细胞群中突变细胞的比例，正式展开Pig-a基因突变试验在药物安全评价领域的研究。由于GPI锚在不同物种间的生物合成高度保守，而且其合成起源于骨髓干细胞，在各类组织细胞及各系成熟红细胞中均有表达。因此，Pig-a基因突变试验可在不同动物种属和不同类型组织中开展。目前，已初步在大鼠、小鼠、猴等动物种属中开展了该试验方法的研究，研究的组织或细胞类型包括外周血红细胞、脾淋巴细胞和骨髓细胞等[10-11]。研究表明，在不同动物物种和不同组织细胞中均可检测出Pig-a基因突变，而且诱发突变比自发突变有一定程度升高，由相同致突变物诱发的突变结果在不同物种间具有一致性。

3 体内Pig-a基因突变试验

3.1 Pig-a基因突变检测方法分类

3.1.1 流式细胞术检测法流式细胞术检测法最初源于对PNH的诊断方法。致突变物使Pig-a基因发生突变可导致细胞GPI合成障碍，致使细胞表面GPI锚链蛋白缺失，通过流式细胞仪分析细胞表型，即可得到Pig-a基因的突变情况。此方法的具体操作是利用荧光标记的单克隆抗体标记目标细胞表面至少一种GPI锚链蛋白(如CD59)以区分突变细胞与正常细胞，以及使用另外一种荧光标记抗体和(或)流式设门策略将不同细胞群区分，从而检测目标细胞群中突变细胞的数量。例如，使用白细胞特异性抗体和散射光将外周血白细胞和血小板与目标细胞(红细胞)区分[8]；又如使用核酸染料区分正染红细胞与网织红细胞和淋巴细胞[7]；此外还可以使用梯度离心法初步将血样中的红细胞、白细胞和血小板分离，富集红细胞后再使用相应的抗体标记[12-13]。

GPI锚的合成起源于骨髓干细胞，其在多功能干细胞及各系成熟红细胞中均有表达。基于流式细胞术的Pig-a基因突变检测方法主要以外周血红细胞或白细胞以及骨髓细胞为样品来源，而较少使用实体组织的单一细胞作为检测样品，其主要原因是处理实体组织时很难获得细胞膜完整且数量足够的单一细胞。从实体组织中获得某单一细胞通常需要对组织进行消化处理，而这种处理方式可能会破坏用于评估Pig-a基因突变情况的GPI锚及其锚链蛋白，从而人为地提高了样品中突变细胞的比例。此外，一些特定类型的实质细胞(如上皮细胞)表面具有自身荧光性质，这可能会影响试验结果的准确性，且不利于该试验方法的开发[10]。

目前，已用于Pig-a基因突变试验研究的单一细胞有大鼠红细胞与网织红细胞、小鼠红细胞与网织红细胞、大鼠T淋巴细胞、猕猴红细胞以及人粒细胞[14-15]等。Miura等[8]以ENU为受试物，以40 mg/(kg·d)每隔1 d腹腔给药3次，采用Anti-CD59/Anti-CD45抗体染色策略，成功在大鼠红细胞中检测出ENU诱导的Pig-a基因突变。由于成熟的红细胞中无DNA结构，单一检测红细胞可能在结果判定上有所影响，因此Miura等在同一项研究中采用流式细胞术检测法进一步检测了大鼠脾T淋巴细胞CD48的缺失情况，综合判定Pig-a基因突变率。研究结果显示ENU诱导的红细胞突变率与脾T淋巴细胞突变率具有一致性。

由于突变细胞非常稀少，采用流式细胞仪检测时需要设置严格的电压和(或)荧光补偿才能从目标细胞群中鉴别出来。因为突变细胞缺失表面蛋白标记物而被识别，所以在样品前处理时必须保证所有细胞能够与各种抗体或反应试剂有效地结合，以及在分析时保证流式细胞仪能够准确地分辨出标记抗体的正常细胞与未标记抗体的突变细胞。因此，荧光种类和数目的选择、合理的设门策略以及对荧光信号重叠的合理解释是流式细胞术检测法的关键所在[16]。

3.1.2 有限稀释克隆法另一种检测方法为有限稀释克隆法。该方法已用于大鼠脾T细胞和猕猴外周血T细胞的Pig-a/PIG-A基因突变检测，且在人T淋巴细胞中已经获得了一些原始试验数据[17]。气单胞菌溶素前体(proaerolysin，ProAER)是一种细菌原毒素，淋巴细胞能够将其转变为毒素(气单胞菌溶素)。该细菌毒素直接与正常细胞的GPI锚(而不是锚链蛋白)特异性结合，导致细胞膜完整性受损以致细胞死亡[18]。因此，缺失GPI锚的Pig-a基因突变细胞能够在含有ProAER的96孔板内生长集落，而未突变的T淋巴细胞则死亡。类似于Hprt基因突变试验以6-TG作为选择剂，有限克隆稀释法则以ProAER作为选择剂。其中不同的是，在Hprt基因突变试验中与刺激T淋巴细胞增殖的分裂素相结合的受体需要GPI锚的正常表达，因此在Pig-a基因突变试验中突变细胞的增殖方式会有所不同。

较流式细胞术检测法而言，有限稀释克隆法能够更直观地鉴别突变细胞，为在体内检测Pig-a基因突变提供了另一个选择，而且该方法的最大优点在于获得的有核突变细胞可用于更深入的研究，如突变谱的检测和突变机制的分析等。但是，有限稀释克隆法类似于Hprt基因突变试验，需要体外细胞培养，耗时耗力，不便于推广，而流式细胞术检测法相对简便、快速，省时省力，在应用方面更具有优势，更便于常规的检测。因此，目前有关Pig-a基因突变试验的研究大多数采用流式细胞术检测法。

3.2 Pig-a基因突变试验的特点

虽然Pig-a基因突变试验已在猕猴、大鼠和小鼠等不同物种间开展，但目前针对该试验方法的研究更多地集中在大鼠上，而且已采用大部分典型的阳性遗传毒性化合物对其进行验证。在Pig-a基因突变试验方法的建立过程中，研究的主要关注点在于给药时间或给药方式对突变率的影响以及试验方法的检测窗、灵敏性、特异性、重现性和可转移性等方面。

3.2.1 检测窗Miura等[19]研究了在单剂量和累积剂量两种给药方案下ENU诱导大鼠产生的Pig-a突变型红细胞在血液中的蓄积效应和持续时间。F344雄性大鼠分别给予单剂量腹腔注射8.9，35.6或142.4 mg/kg ENU；以及每周1次连续4周腹腔注射8.9和35.6 mg/kg ENU，于给药前和给药后26周里不同时间点采集血样，用流式细胞仪检测突变红细胞(RBCCD59-)的发生率。研究显示，单剂量ENU诱导的RBCCD59-发生率具有时间依赖性和剂量依赖性，其最大值开始于给药后第6周，而且这些显著的突变率一直持续至给药后第6个月(最后一个采样点)。而在累积剂量给药方案中，分4次剂量每周1次给予ENU所诱导的Pig-a基因突变率与相同总剂量单次给药所产生的突变率相似，即在两种给药方案下同一总剂量单次或分次给予ENU所诱导Pig-a基因突变率最大值非常接近。研究结果表明ENU诱导的Pig-a突变型红细胞能够以近似相加的方式在血液中蓄积，而且一旦在外周血出现就会存留至少6个月，这些特征为Pig-a基因突变试验在亚慢性或慢性研究中检测弱致突变物的遗传毒性提供了可能。

黄色素的主要成分是类胡萝卜素。类胡萝卜素是生物体内通过类异戊二烯途径合成而呈黄色、橙红色和红色的一大类萜类色素物质[1-2]。类胡萝卜素又可分为胡萝卜素和叶黄素两大类，胡萝卜素是不含氧的类胡萝卜素的总称，叶黄素则是含氧类胡萝卜素的总称。面粉中的类胡萝卜素，特别是叶黄素和黄酮类物质是面粉黄度形成的主要原因[3]。

在上述研究的基础上，Phonethepswath等[13]观察了突变型红细胞(RBCCD59-和RETCD59-)在大鼠外周血中出现与消除的动力学变化，以探讨该试验方法合理的给药时间与检测窗口期。研究者们分别以ENU、DMBA、N-甲基-N-亚硝基脲(N-methyl-N-nitrosourea，MNU)、4-硝基喹啉-1-氧化物(4-Nitroquinoline-1-oxide，4NQO)和苯并[a]芘(benzo[a]pyrene，B[a]P)等 5 种典型遗传毒性阳性剂作用于雄性Wistar Han大鼠和SD大鼠(仅限ENU和DMBA)，连续3天灌胃给药，于实验第1、4、15、30、45、90以及180天(仅限ENU)采血，利用流式细胞仪检测受试物诱导产生的RBC突变表型(RBCCD59-)和RET突变表型(RETCD59-)的发生率；同时尝试以染色体损伤作为第2个遗传毒性终点结合至该研究中，于实验第4天采血检测微核网织红细胞(Micronucleated Reticulocyte，MN-RET)的发生率。研究结果显示，以上5种阳性剂对两种不同种属的大鼠均产生Pig-a基因突变以及染色体损伤。不同受试物诱导的RBCCD59-和RETCD59-发生率一般从第15天开始出现显著性递增：RETCD59-发生率大约在两周左右(第15天前后)达至峰值，而RBCCD59-发生率则需要大约45天才能达到峰值。此外，研究发现ENU诱导的RBCCD59-和RETCD59-持续存留于Wistar Han大鼠血液中至少6个月，这些研究结果与Miura等[24]的研究结果保持一致。

基于Phonethepswath等[13]的研究，Dertinger等[20]考虑到Pig-a突变型红细胞在血液中的蓄积效应可能有利于Pig-a突变试验与亚慢性或慢性毒性研究的整合，因此同样以上述5种典型阳性剂在雄性Wistar Han大鼠中开展28天重复给药研究，分别于试验给药前1天，首次给药后第、15、29和56天采血进行外周血RBCCD59-和RETCD59-发生率的检测，同时于实验第4天和第29天采血检测MN-RET，以探讨将基因突变和染色体损伤两个遗传终点整合至28天重复给药毒性试验中的可行性，以及观察这两个遗传终点在该试验系统中的灵敏性。结果显示，除了4NQO外，其余4个受试物均可导致MN-RET的发生；而所有受试物在28天重复给药试验系统中均可诱导Pig-a基因突变。研究表明突变反应较早地发生在RET，且RETCD59-发生率于实验第29天接近峰值或达到峰值；然而，在实验第29天时RBCCD59-的发生率递增比较温和，且需要更长的时间才能到达峰值(大约在第56天)。鉴于RET出现突变反应的时间较RBC早，而且RET出现峰值的时间与常规的28天重复给药毒性研究的实验期相对吻合。因此，Phonethepswath等和Dertinger等均建议将RETCD59-的发生率作为亚慢性或慢性毒性研究中Pig-a基因突变的检测指标。

以上这些研究表明，Pig-a基因突变试验具有较长的检测窗，允许试验过程中重复收集样本检测同一动物不同时间点的突变率，而且能够检测动物经重复给药后在体内蓄积的致突变作用。与其不同的是，一些常用的体内遗传毒性试验，如微核试验和彗星试验，必须在给药后一个相对短的检测窗内才能检测到受试物对动物产生的遗传毒性。因此，Pig-a突变试验的这些优点为其在亚慢性或慢性研究中的应用提供了可能。

3.2.2 灵敏性和特异性迄今的研究结果表明，在流式细胞术检测法中大鼠RBC和RET的Pig-a基因自发突变率非常低(小于5×10-6)[13-14，20]，而在有限克隆稀释法中脾淋巴细胞自发突变的背景值同样相似[14]。这些红系细胞在Pig-a位点上的自发突变背景值与淋巴细胞在内源性Hprt基因位点上的自发突变背景值非常具有可比性，而且远低于大多数转基因位点的自发突变背景值。报告基因低频率的自发突变能够有效提升该试验方法的灵敏度，因此这些在Pig-a位点上相对低的自发突变背景值有望成为发展Pig-a基因突变试验的一大优势。

对于RBC和RET的Pig-a的基因突变方面也有一定的差异，Yoshida[21]研究发现尽管芘在RBC Pig-a和PIGRET基因突变测中都是阴性，但是溶媒对照组Pig-a的突变频率在两种测定之间明显不同。在溶媒对照组中，对于RBC Pig-a和PIGRET测定，试验测试阶Pig-a基因突变的频率范围分别为(2.2～4.8)×10-6和(0.3～1.3)×10-6。而在40 mg/kg ENU处理组中，PIGRET基因突变频率相较于对照组的倍数(20.9倍)远高于RBC Pig-a的基因突变频率(13.7倍)。较低的溶媒对照组PIGRET的突变频率可以提高该试验的灵敏度，这也是PIGRET基因突变试验的优势之一。此外，ENU10 mg/kg组和40 mg/kg组，PIGRET基因突变频率明显增加在7 d内，但RBC在ENU10 mg/kg组需要至少14 d来检测Pig-a基因突变频率的增加。由于在大鼠外周血中RETs的转化时间比RBC更短，故PIGRET试验可以比RBC Pig-a试验更早地检测ENU的致突变性。

至于鉴定已知致突变物和致癌物的能力方面，一项研究报道[22]采用41种化合物在大鼠上开展针对Pig-a基因突变试验灵敏性的验证试验，其中包括26个在Ames试验中呈阳性反应的化合物以及一些非遗传毒性化合物。大部分预期在试验中呈现阳性反应的受试物均可导致Pig-a基因突变。这些受试物除了包括一些直接与DNA反应的烷化剂外，还包括一些经体内代谢活化后才能暴露出相应遗传毒性的化合物，如2-乙酰氨基芴、马兜铃酸、二乙基亚硝胺、B[a]P和DMBA等[23]。这些化合物经体内充分活化后，其代谢产物因破坏红系前体细胞而产生阳性结果。另一方面，Pig-a基因突变试验对于假定的非遗传毒性化合物也呈现出一定特异性，如盐酸哌醋甲酯[18]和芘[37]。上述资料显示，该试验方法已经呈现出较高的灵敏性(即检测遗传毒性致癌物的能力)和特异性(即正确识别所有非遗传毒性化合物的能力)。

尽管个别阳性剂(如ENU和DMBA)在Pig-a基因位点上的致突变作用较为强烈，但是其他一些化合物(如B[a]P和4-NQO)经短期暴露后产生的致突变作用则相对温和。在这些情况下，报告基因相对低的自发突变背景值有助于提高试验方法的灵敏性。为了比较Pig-a基因与其他现有的报告基因对化合物致突变作用的敏感性，Miura等[24]在同一批大鼠上比较了ENU(100 mg/kg)诱导红细胞与T淋巴细胞在Pig-a基因位点和Hprt基因位点上的突变反应。他们使用流式细胞术检测法对比红细胞和T淋巴细胞的Pig-a基因突变率，同时使用有限克隆稀释法对比T淋巴细胞在Pig-a基因位点和Hprt基因位点上的突变反应。另一个相似的研究则在少数猕猴上进行，Dobrovolsky等[12]同样对比了ENU诱导红细胞与T淋巴细胞在Pig-a基因位点上的突变反应，同时对比了T淋巴细胞的Pig-a基因突变率和Hprt基因突变率。这两项研究的结果显示，无论是在Pig-a基因位点还是Hprt基因位点上，ENU诱导的红细胞和T淋巴细胞突变率均具有可比性。此外，Lemieux等[25]采用MutaTMMouse转基因模型对比研究了连续28 d重复给予B[a]P后诱导网织红细胞的Pig-a基因突变率和骨髓细胞的lacZ基因突变率。研究者们发现在这两个基因位点上的突变率均呈现双倍剂量性递增，且在不同剂量组中出现非常相似的剂量依赖性动力学变化。尽管这些研究显示不同报告基因对化合物致突变作用的敏感性存在差异，但目前在致突变物和报告基因没有得到充分研究的情况下对Pig-a基因突变试验的灵敏性下定论尚为时过早。

本课题组经几年的实验研究，形成了本实验室可行且稳定的实验方法，蒲江等[32]对实验方法进行建立、优化，并做了进一步的评估。该研究选用合适的阳性剂EMU和DMBA，得到与溶剂对照组相比Pig-a基因突变频率存在显著性差异的结果。陈高峰[15]等采用免疫磁性分离的方法对试验体系进行进一步的优化并应用于市售的药物，研究把盐酸丙卡巴肼与乌拉坦作为受试物采用多终点结合体内遗传毒性进行研究，试验分为3 d和28 d给药组。研究结果显示经PCZ与EC短期及长期暴露后，与对照组相比RETCD59-和RBCCD59-发生率均呈现明显的时间依赖性和剂量依赖性变化。两种受试物在Pig-a基因突变试验、外周血微核试验、骨髓微核试验和彗星试验均呈现阳性反应。

4 体外Pig-a基因突变试验

随着动物实验“3R”原则的提出，体外Pig-a基因突变试验的形式能够实现对动物体内试验的替代，且为体内试验提供预测形成互补。尽管存在实际试验需求，但体外Pig-a基因突变试验在国内外的研究进展却十分缓慢。2015年Kruger等[33]人建立了相应的Pig-a体外变异体B淋巴母细胞样TK6细胞的检测方法，通过多色流式细胞术用抗GPI锚定蛋白CD55和CD59的PE-抗体结合物检测GPI状态，对突变的TK6细胞样品进行分析，并对突变体进行定量检测，试验结果证实体外Pig-a基因突变法检测甲基磺酸乙酯、4-硝基喹啉1-氧化物和UV-c辐射的致突变性，结果显示剂量依赖性且有统计学意义，表明体外Pig-a试验可以补充体内Pig-a试验，与其他哺乳动物体外致突变试验相比，具有明显的优势。随后，Kruger等[34]又对TK6细胞GPI相关基因型与表型的关系进行了研究。David R[35]在之前研究的基础上，建立并验证一种对小鼠淋巴瘤细胞L5178Y体外Pig-a基因突变的检测方法，试验中采用的细胞系与Kruger等有所不同，David R采用小鼠淋巴瘤细胞L5178Y代替Kruger试验中采用的TK6细胞，考虑到TK6细胞比L5178Y细胞有较高的Pig-a自发突变背景值，需清除预先存在的自发突变细胞，降低试验中存在的自身突变对于试验结果的影响，L5178Y就以上原因而言存在有一定优势。

Rees[36]等人主要研究了人类细胞：TK6细胞，AHH-1细胞以及MCL-5细胞的体外PIG-A的基因突变。由于TK6细胞自身存在较高的背景突变值，试验中采用了3种不同的方法对用于优化TK6细胞内CD59表达的富集策略进行了比较，研究数据表明：荧光激活细胞分选法在平均CD59野生型富集方面有最佳效果，野生型细胞富集率达(95.3±3.0)%，Dynabead®磁珠检索和克隆扩增分别产生(89.1±6.5)%和(70.8±25.3)%的CD59细胞阳性率。在不同的细胞系之间，该研究表明，MCL-5细胞内的独立PIG-A测定比基于TK6细胞的测定更有前途。

5 Pig-a基因突变试验的应用前景

Pig-a基因突变试验能够跨物种跨组织检测体内多种类型的突变作用，并能有效整合至其他体内试验中，在药物临床前安全性评价中具有非常广阔的应用前景，有望成为体内遗传毒性试验的新选择，从而弥补现有遗传毒性试验组合的不足。相对于体外Hprt基因突变试验等以及体内试验方法，以外周血红细胞和网织红细胞为检测靶点的Pig-a基因突变试验具有快速简便及实用性强等优点。而且，该试验方法检测窗较长，允许在试验过程中重复采集样本，无创、连续、动态地监测动物体内的突变反应，并可在不影响其他检测终点的前提下将试验整合至药物亚慢性或慢性毒性研究中，符合ICH遗传毒性试验指导原则S2(R1)对动物实验“3R”原则的要求，适应当前药物毒理学研究和安全性评价的发展趋势。在基于大鼠外周血的测定中，通过荧光标记的抗体结合流式细胞术来定量分析红细胞表面上缺失CD59的数目以确定Pig-a突变表型细胞的频率。该试验已达到监管的可行性，因此该试验方法建议作为的ICH M7[37]步骤4文件中细菌突变试验在非S9代谢活化条件下结果为阳性时的追踪实验。

该方法应用于药物遗传毒性评价仍需大量的研究和验证工作，以及需要积累更多数据对其方法进行标准化。除了采用更多的弱致突变物或非致突变物对方法的灵敏性和特异性进行验证外，还需开展研究证实GPI锚链蛋白的缺失真正源于Pig-a基因位点上的突变，而非由基因沉默或预先存在的突变体克隆扩增而导致。此外，还需研究是否能将该方法应用至有核的非红细胞系(如粒细胞和淋巴细胞)或其他实体组织细胞上(如肝和肾)。相信在国内外相关领域研究人员的共同努力下，Pig-a基因突变试验定能得到进一步发展与完善，在药物非临床遗传毒性研究以及其他领域中发挥重要作用。