环状RNA 在肿瘤领域中的研究进展△

刘欢妹，靖长友，张曙光，王雪，张鑫鑫，于胜吉

国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院骨科，北京 100021

环状RNA（circular RNA，circRNA）是一类以共价键结构形成，不具有3'和5'末端头尾结构的环状长链非编码RNA。circRNA因其闭环环状结构对核酸外切酶具有较高的耐受性，不易被降解，因此，可稳定存在于真核生物细胞的细胞质中。1976年，Sanger等[1]利用电子显微镜首先在植物感染的病毒颗粒中观察到了共价闭合环装RNA分子，并将其命名为circRNA。circRNA最初被认为是RNA剪接过程中产生的无功能产物。随着高通量测序技术和生物信息学的发展，circRNA在基因转录、转录后修饰及翻译调控中的作用逐渐被证实。circRNA在神经系统疾病、心血管疾病和肿瘤等领域均积累了一定的研究成果，这提示circRNA具有疾病特异性。乳腺癌、肝癌、胶质瘤和结直肠癌等恶性肿瘤中均存在circRNA的异常表达，circRNA可成为潜在的肿瘤疾病诊断指标和治疗靶点。本文就circRNA的生物学特征及其在肿瘤领域的研究进展进行综述。

1 circRNA 的生成与降解

circRNA是由特殊的前体mRNA通过可变剪接产生的。根据前体mRNA的不同，circRNA可分为外显子circRNA、内含子circRNA、外显子-内含子circRNA和基因间型circRNA[2]。外显子circRNA的形成机制为套索驱动的环化和内含子配对驱动的环化[3]，前者是指一个外显子的3'剪接供体与另一个外显子的5'剪接受体共价结合后切除内含子，然后形成circRNA；后者是指由两个内含子先通过碱基互补配对形成环状结构，再切除内含子，最后形成circRNA。内含子circRNA由内含子独立环化而来，其结构的形成依赖于含有邻近5'剪接位点处的7个核苷酸GU富集元件和3'剪接位点处的11个核苷酸C富集元件[4]。某些环化的外显子中间保留有内含子，此类circRNA为外显子-内含子circRNA。circRNA具有特异的内切酶位点，可通过碱基互补的方式调控靶基因mRNA的翻译或降解[5]。有研究发现，在哺乳动物细胞内，circRNA通过进入细胞外囊泡的方式进行清除[6]，但该研究为体外实验，关于人体内circRNA的降解机制尚待进一步研究。

2 circRNA 的生物学功能

2.1 miRNA 的海绵作用

微小RNA（microRNA，miRNA）是内源性非编码双链线性RNA，具有一定的分子特异性和靶向性，是基因转录后调控的重要元件，可竞争性结合并降解靶mRNA，从而影响疾病的发生与发展。circRNA可与相应的miRNA竞争性结合，从而调控靶基因的表达。Hansen等[7]在人和小鼠的大脑中发现了一种高表达的circRNA，即ciRS-7，并证实miRNA-7的环状RNA海绵（circular RNA sponge for miRNA-7，ciRS-7）包含70多个选择性保守的miRNA靶位点，可明显抑制miRNA-7的表达。circRNA脑降解相关蛋白1（cerebellar degeneration-related protein 1，CDR1）/ciRS-7的过表达上调了miRNA靶基因的表达，而敲除它具有相反的作用；同时证实睾丸特异性circRNA Sry9是一种miRNA-138海绵，表明circRNA产生的miRNA海绵作用是一种普遍现象，这也是首次对circRNA自然表达功能进行分析的研究。Hairong等[8]研究表明，竞争性内源RNA ciRS-7可通过调控其靶点miRNA-7/KLF4和核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信号途径促进食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）细胞的迁移和侵袭，表明circRNA作为竞争性内源RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）与miRNA竞争性结合，对上下游的基因通路进行调控，从而调控基因的表达。

2.2 翻译蛋白

circRNA为非编码RNA。有学者认为，理论上通过插入病毒内部核糖体始动位点，将circRNA翻译成多肽或蛋白质，这从circRNA结构上是可以实现的[9]。Yang等[10]研究证实，circRNA可以通过碱基修饰的N6-甲基腺苷（m6A）位点驱动转录起始，翻译蛋白。Legnini等[11]通过对人和鼠的肌细胞体外分化过程中的circRNA进行高通量基因组测序及对其表达谱进行分析发现，circ-ZNF609可特异性控制成肌细胞的增殖。circ-ZNF609包含开放阅读框，与线性转录相同，从起始密码子开始，终止于终止密码子，且认为circ-ZNF609翻译蛋白质的功能与其含有核糖体结合位点有关，提供了真核生物中circRNA编码蛋白的有力证据。叉头框蛋白O3（forkhead box O3，FOXO3）在肿瘤的进展中起重要作用，Du等[12]发现circ-FOXO3是一种circRNA，其作为一种内源性细胞质，可以与E3泛素蛋白连接酶MDM2结合，并调节其在多泛素化修饰和降解靶蛋白中的作用，从而发挥促进、定位和管理蛋白质的功能。因此，越来越多的研究证实了circRNA可结合并编码蛋白从而发挥生物学效应。

2.3 调节RNA 结合蛋白

RNA结合蛋白（RNA binding protein，RBP）在转录后基因表达的调节中起着重要作用，可发挥RNA选择性剪接、维持RNA稳定、RNA转运和翻译等多种生物学功能，并参与细胞的增殖、分化、迁移、衰老、凋亡及对氧化应激的细胞应答。有研究表明，circRNA可竞争性结合RBP，充当RBP的海绵，从而改变剪接模式或mRNA的稳定性。与对应的线性mRNA相比，circRNA上的RBP结合位点较少，但仍有证据证实circRNA与RBP具有相互作用的关系。这可能是因为circRNA可以采用与相同序列的相关线性分子不同的三级结构，或者可通过circRNA中结合在一起的序列产生新的蛋白结合位点[12]。另外，circRNA还可调控RBP的表达，且由肿瘤抑制因子WWOX的亲本基因编码的2个circRNA（KIRKOS-73和KIRKOS-71）可以调节p53的生成。同时新的研究结果表明，hsa_circ_0055538通过p53/Bcl-2/caspase信号通路参与口腔鳞状细胞癌的进展[13]。

2.4 调控亲本基因表达

研究表明，circRNA在转录后和基因表达的调控中起着举足轻重的作用，在人类细胞中发现一类与RNA聚合酶Ⅱ（polymeraseⅡ，PolⅡ）相关的一类circRNA，其结构为内含子循环包绕外显子，即外显子-内含子circRNA（exon-intron circRNA，EIciRNA）。EIciRNA主要定位于细胞核内，与U1核小核糖核蛋白（U1 small nuclear ribonucleoprotein，U1 snRNP）颗粒和RNA PolⅡ相互作用，促进其亲本基因的转录[14]。

3 circRNA 在肿瘤中的研究

3.1 乳腺癌

近年来，越来越多的研究报道circRNA在乳腺癌的发生、侵袭和转移过程中异常表达。Smid等[15]分析了348例原发性乳腺癌的RNA序列数据，最后确定了95 843个circRNA，其中20 441个circRNA是已知的。在与同一基因外显子边界相匹配的环状结构中，668个circRNA与线性基因表达水平的相关性较差甚至呈负相关；同时，确定了与乳腺癌亚群相关的circRNA表达谱，并进行了详细的生物信息学分析；验证了敲除siRNA介导的circCONT2基因可明显降低乳腺癌细胞系MCF-7和BT-474的存活率，从而证实了circRNA的生物学功能。Yin等[16]将乳腺癌患者和健康志愿者的血液进行了circRNA芯片测序，结果显示，共19种circRNA的表达上调，22种circRNA的表达下调，并通过绘制乳腺癌表达谱，认为hsa_circ_0001785可作为诊断乳腺癌的分子标志物；通过对三阴性乳腺癌患者的乳腺癌组织进行circRNA芯片测序发现，circEPSTI 1（hsa_circRNA_000479）明显升高。Chen等[17]进行的体内试验表明，circEPSTI1与miRNA-4753、miRNA-6809结合可发挥海绵的作用，调节bcl11a的表达，从而影响肿瘤坏死因子的增殖和凋亡。Liu 等[18]研 究证实 circRNA-MTO1（hsa_circRNA_007874）与肿瘤坏死因子受体相关因子4（tumor necrosis factor receptor associated factor 4，TRAF4）相互作用，阻断了TRAF4激活Eg5翻译，从而抑制了Eg5蛋白的表达水平，并降低了乳腺癌细胞的活力，这些通路有望成为乳腺癌靶向治疗的新靶点。

3.2 肺癌

Zhu等[19]通过对肺癌组织进行circRNA测序发现，39个circRNA的表达上调，20个circRNA的表达下调。其中hsa_circ_0013958的表达明显上调，并能够促进肺癌细胞的增殖、侵袭，并抑制其凋亡，可作为肺癌早期筛查的重要指标。Tan等[20]研究证明F-circEA-4a是由EML4-ALK-v3b后剪接产生的促肿瘤型的circRNA，是一种新型的非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）生物标志物；此外，EML4-ALK-v3b衍生的circRNAF-circEA-2a主要位于细胞质内，可促进NSCLC细胞的迁移和侵袭，但对NSCLC细胞增殖的影响较小；而F-circEA-2a存在于肿瘤中，而不存在于EML4-ALK融合基因的NSCLC患者的血浆中，进一步支持了F-circEA-4a对EML4-ALK阳性NSCLC的诊断价值。circRNA是肺癌的重要分子标志物，在肺癌的发生发展中起重要作用。Wang等[21]研究证实了circPTK2（hsa_circ_0008305）对 miRNA-429/miRNA-200b-3p的海绵作用，可通过控制转录中介因子 1-γ（transcriptional intermediary factor 1-γ，TIF1γ）抑制TGF-β诱导的上皮-间充质转化和NSCLC细胞的转移，且表明circPTK2过表达对NSCLC的转移具有抑制作用。

3.3 结直肠癌

Jim等[22]研究发现hsa_circ_0136666可通过竞争性结合结直肠癌细胞中的miRNA-136从而上调SH2B1的表达；SH2B1的过表达可逆转hsa_circ_0136666对结直肠癌进展的抑制作用，表明hsa_circ_0136666可通过miRNA-136/SH2B1轴促进结直肠癌的进展。Li等[23]研究发现，circITGA7可与miRNA-370-3p结合，拮抗miRNA-370-3p对神经纤维蛋白1的抑制，通过阻断Ras信号通路和促进整合素α7（integrin subunit alpha 7，ITGA7）基因的转录从而抑制结直肠癌细胞的增殖和转移。circRNA不仅与结直肠癌的进展关系密切，还可用于评估患者对化疗药物的耐药性。Abu等[24]通过对化疗耐药和化疗敏感的结直肠癌细胞进行circRNA测序及对差异表达谱进行分析发现，共有773个circRNA的表达上调，732个circRNA的表达下调，其中，差异表达的hsa_circ_32883可能是化疗敏感的生物学标志物。

3.4 神经胶质瘤

Renjie等[25]研究发现，circNT5E通过直接结合miRNA-422A并抑制其活性，降低NT5e、sox4、磷酯酰肌醇-3激酶催化亚单位α（phosphatidylinositol-3 kinase catalytic subunit alpha，PI3KCA）、磷酸化蛋白激酶 B（phosphorylation protein kinase B，p-AKT）和磷酸化 Smad2（phosphorylated Smad2，P-Smad2）的表达水平，从而影响神经胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。Zhang等[26]通过核糖体新生链复合物结合RNA测序（RNC-seq）发现了几种可能由环RNA编码的肽，并进一步鉴定出由基因间长链非蛋白编码RNA p53诱导的转录物（long intergenic non-protein-coding RNA p53-induced transcript，LINC-PINT）编码的87-氨基酸肽，直接与聚合酶相关因子复合物（polymerase associated factor complex，PAF1C）相互作用，抑制多种肿瘤基因的转录；与正常组织相比，胶质母细胞瘤组织中的87-氨基酸肽和circRNA的表达水平较低，这为circRNA编码蛋白及其在神经胶质瘤中的潜在作用提供了新的证据。circ-SHPRH在内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site，IRES）元件的驱动下产生一种新的肿瘤抑制蛋白SHPRH-146aa，SHPRH-146aa与全长蛋白协同发挥作用，保护诱导分子免于被降解，从而发挥肿瘤抑制剂的作用。Begum等[27]研究表明SHPRH-146aa高表达胶质母细胞瘤患者的生存期较长。

3.5 前列腺癌

有研究通过对前列腺癌（prostate cancer，PCA）组织和癌旁组织中的circRNA进行测序，筛选了1021个异常表达的circRNA，证实了PCA中circRNA的异常表达[28]。Chen等[29]对144例PCA组织进行全RNA基因组测序，筛选出了7232个与肿瘤相关的circRNA，其中，circCSNK1G3与miRNA-181结合可促进肿瘤细胞的生长；circRNA可调节其亲本基因的转录水平，90%的circRNA在肿瘤的增殖过程中发挥着重要的作用，而其线性对应产物却无此种作用，表明circRNA在转录过程中独立发挥作用。Yang等[30]研究发现，Amotl1基因衍生的circRNA circAMOTL1L在人类PCA中的表达水平较低，而下调的circAMOTL1L通过下调E-钙黏蛋白的表达和上调波形蛋白的表达从而促进PCA细胞的迁移和侵袭，导致上皮-间充质转化和PCA进展。此外，该研究还发现RBM25基因可直接与circAMOTL1L结合并诱导其发生生物作用，而p53通过直接激活RBM25基因对上皮-间充质转化过程进行调节。这些研究证实，p53/RBM25介导的circAMOTL1L-miRNA-193a-5p-Pcdha调控轴与PCA细胞的上皮-间充质转化过程有密切关系。

3.6 肝癌

Qiu等[31]通过绘制肝癌组织和癌旁组织circRNA表达谱，发现有38个circRNA的表达下调，4个circRNA的表达上调，其中，circADAMTS13表达上调与肿瘤大小呈负相关，与患者的预后呈正相关，可作为肝细胞癌预后的评价指标。Wei等[32]通过对mRNA、circRNA、miRNA进行全基因组测序发现，circ-CDYL在早期肝细胞癌组织中的表达水平明显升高，可作为miRNA-892a和miRNA-328-3p的海绵，与编码肝癌衍生生长因子（hepatomaderived growth factor，HDGF）和缺氧诱导因子天冬酰胺羟化酶（hif1an）的mRNA相互作用，激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）-蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，也称AKT）-雷帕霉素靶蛋白复合物1（mammalian target of rapamycin complex 1，MTORC1）/β-catenin 和Notch2通路，促进原癌基因含重复凋亡结构杆状病毒抑制剂5（baculoviral inhibitor of apoptosis protein repeat containing 5，BIRC5）、survivin和myc效应蛋白杆状病毒凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）重复序列的表达，这揭示了肝细胞癌早期以circRNA为中心的非编码调控RNAS网络和早期肝癌鉴别肿瘤标志物。除了circRNA-miRNA-mRNA轴在肝细胞癌发生发展中的作用得到了初步证实外，circRNA与mRNA结合蛋白协同调控肝细胞癌发生发展的机制也逐渐受到学者们的重视。Liang等[33]的研究证实了circβ-catenin（circ-0004194）可通过拮抗糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）诱导的β-连环蛋白磷酸化和降解从而稳固全长β-连环蛋白表型，激活WNT信号通路，调节肝癌细胞的生长。

3.7 胃癌

circPVT1在胃癌组织中高表达，可作为miRNA-125家族的海绵从而促进肿瘤细胞的增殖。Chen等[34]研究表明，circPVT1可作为胃癌患者总生存情况和无瘤生存情况的独立预测指标。Ding等[35]研究发现circ-DONSON在胃癌组织中高表达，通过激发NURF复合物启动SOX4从而调控转录，且其高表达与肿瘤的进展和不良预后呈正相关。Huang等[36]发现，来源于AKT3基因外显子8、9、10和11的circAKT3（hsa_circ_0000199）在顺铂耐药的胃癌细胞和组织中高表达，circAKT3作为miRNA-198的海绵可以上调PIK3R1的表达，增加对顺铂的耐药性。

3.8 骨肉瘤

有研究表明，Hsa_circ_0081001可作为骨肉瘤诊断和预后预测的生物标志物，可动态监测和反映骨肉瘤患者的病情[37]。circTADA2A在骨肉瘤组织和细胞中呈高表达，并可作为miRNA-203a-3p的海绵上调肿瘤启动子CREB3，从而调控骨肉瘤的发生和转移[38]。

3.9 多肿瘤的研究

有部分研究同时纳入了几种肿瘤进行观察。Zheng等[39]通过对6例正常组织标本（脑、肺、胃、肝、心脏和结肠）和7例肿瘤组织标本（膀胱癌、肾癌、胃癌、肝细胞癌、乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌）进行RNA测序，检测出27 000多个circRNA，证实在正常组织和肿瘤组织中，不同circRNA的表达情况是不同的。circHIPK3是来源于HIPK3基因外显子2的一类circRNA，通过沉默circHIPK3能够明显抑制人类细胞的生长；该研究通过荧光素酶筛选分析发现，circHIPK3对9个miRNA具有海绵作用，且有18个潜在的结合位点，其中circHIPK3可与miRNA-124直接结合并抑制其活性。Chen等[40]发现，circAGO2在胃癌、结肠癌、前列腺癌和神经母细胞瘤中的表达上调，且与人抗原R蛋白相互作用，从而减少其与亲本基因AGO2的结合，抑制AGO2/miRNA介导的基因沉默功能，从而促进肿瘤细胞在体内外的生长、侵袭和转移。

4 小结与展望

近年来，肿瘤的发病率逐渐升高，肿瘤的早期筛查和靶向治疗已成为目前肿瘤领域的研究热点。circRNA起初被认为是RNA中拼接错误的产物，是无功能的，而进一步的深入研究使人们改变了对circRNA的认知。尽管对circRNA的研究处于起步阶段，但已代替miRNA、lncRNA成为非编码RNA研究中的一个新方向。由于circRNA具有闭环结构使其可稳定存在于细胞质中不被降解，其疾病特异性使其可作为肿瘤早期筛查和预后评价的标志物，对于阐明肿瘤发生发展的具体机制、作为新的有效靶点具有重要意义。目前关于circRNA-miRNA-mRNA轴的研究较多，也有少量关于circRNA与RNA结合蛋白通路的研究，然而对circRNA在肿瘤发生发展中发挥的具体生物学功能及其机制尚未明确，但随着目前高通量测序技术的逐步完善和测序价格的降低，使更多的研究者将投入大量的人力、物力、财力研究更多关于肿瘤的测序数据以及非编码RNA的网络作用关系，为肿瘤基因治疗提供新的方向。