1型糖尿病动物模型和干细胞治疗的研究进展

陈昕涛，王敏君，严文韬，孙 宇，杨 桃，朱海英，胡以平，*，陈 费，*

(1.海军军医大学基础医学院细胞生物学教研室，上海 200433；2.海军军医大学基础医学院学员四大队，上海 200433)

糖尿病是一种以高血糖为特征，由致病因素引起胰岛素分泌缺乏或胰岛素抵抗继而引发糖代谢紊乱的疾病。目前分为1型糖尿病、2型糖尿病、特殊类型糖尿病和妊娠期糖尿病。1型糖尿病是一种由T淋巴细胞介导的自身免疫性疾病，由于胰腺β细胞被破坏导致胰岛素分泌相对不足，进而使机体多器官长期暴露于高血糖环境，导致严重的心血管、眼、肾及神经系统病变。如治疗不当或不及时将会出现严重的并发症，轻者影响患者的生活质量，重者导致患者死亡[1]。根据国际糖尿病联盟的统计，截至2015年，全球已有4.15亿糖尿病患者，另有3.18亿成年人处于糖耐量异常状态，而糖耐量异常的人群发生糖尿病的风险很高。目前1型糖尿病主要治疗方法是药物治疗，患者需要保证不间断高质量的胰岛素注射。1型糖尿病患者目前仍无法治愈，终生药物治疗增加了感染、酮症酸中毒、低血糖等急性并发症及视网膜、神经、肾脏、心脑血管疾病等慢性并发症的风险。胰腺β细胞的再生治疗和替代治疗或成为治愈1型糖尿病的有效途径，但这种治疗方式面临的难题是胰腺β细胞来源不足及在体内血糖调节功能不能长久维持。相关研究表明，通过对干细胞诱导分化、重编程以及转分化技术获得的有功能的胰岛素分泌细胞具有广阔的前景，而糖尿病的动物模型作为研究细胞替代法治疗1型糖尿病的验证工具起到了至关重要的作用。本文根据目前的研究现状综述了1型糖尿病常见动物模型以及相关干细胞治疗这些模型的研究进展，以期引发思考，开阔思路，为干细胞治疗1型糖尿病的临床转化提供参考和借鉴。

1 1型糖尿病常见动物模型

1型糖尿病的主要特征是胰腺β细胞受到自身免疫系统的攻击，导致胰岛素分泌不足。因此，在制备动物模型时，可以通过不同的方法使动物胰岛素缺失。根据造模的不同方法，1型糖尿病动物模型主要包括3大类型：化学损伤胰腺β细胞1型糖尿病动物模型、自发性1型糖尿病动物模型、病毒感染诱导1型糖尿病动物模型。

1.1 化学损伤法制备1型糖尿病动物模型

该方法主要通过化学手段对胰腺β细胞进行大量破坏，导致内源性的胰岛素急剧减少，引发模型动物糖耐量异常、高镁血症和体质量减轻等症状[2]。由化学损伤法制备1型糖尿病动物模型操作十分简便，既可以用于对啮齿类动物造模，也适用于更高等的动物。如向猪注射化学试剂可以诱导1型糖尿病的发生[3]。一般通过两种试剂来引发1型糖尿病：链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)和四氧嘧啶(alloxan，ALX)。

STZ是一种使胰腺β细胞产生毒素的广谱抗菌素，它通过葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)转运到胰腺β细胞，导致其DNA发生烷基化，生成NO和自由基，破坏细胞，致使β细胞无法分泌胰岛素，因而出现1型糖尿病症状[4]。STZ注射一般有两种方式，一是单次大剂量注射，注射药物剂量为150～200mg/kg。单次大剂量注射操作方便省力，用药节约，但模型的成模率不是很高；另一种方式为多次低剂量注射STZ，剂量通常为50mg/kg，连续5d，低剂量注射逐步损伤胰岛细胞，可以引发自身对胰岛的免疫应答，最终使模型动物血糖调节失代偿，出现多饮、多尿、血糖持续偏高的1型糖尿病症状。相比于单次大剂量注射，多次低剂量注射的成模率高，且死亡率低[5]。单次大剂量注射STZ的诱导模型目前广泛用于1型糖尿病药物试验，而多次小剂量诱导模型主要用于探讨胰岛坏死以及增殖的机制。

四氧嘧啶(ALX)是一种尿酸类衍生物，进入机体代谢后产生5-羟基巴比土酸、过氧化物和超氧自由基。超氧自由基与葡萄糖转运体GULT2结合，进入胰岛β细胞后使DNA烷基化，因而可以选择性的破坏胰腺β细胞，引起胰岛素缺乏，致使模型动物出现1型糖尿病典型症状。ALX的注射剂量通常为100～200mg/kg，缺点是对机体的其他器官毒性很大，因此不能通过加大剂量的腹腔注射来取代尾静脉注射，但剂量不足又会导致成模率不高。有研究[6]表明剂量为37.5mg/kg分3次隔天注射的方案较为合适，这样对胰腺β细胞的损伤作用较为缓和，血糖逐步上升，可以明显降低模型动物死亡率并提高成模率。

上述的两种化学法通过化学毒素类物质破环胰岛细胞，可以在较短时间内引起胰岛素分泌大量减少，一定程度上模拟出了1型糖尿病患者多饮、多尿、血糖增高、体质量减轻的症状。因STZ和ALX的稳定性不强，所以在注射时应注意试剂现配现用，遮光保存等。

1.2 自发性1型糖尿病动物模型

1.2.1 NOD小鼠 NOD小鼠(non-obesediabeticmouse)是JCL-ICR品系的糖尿病小鼠近亲杂交而得到的非肥胖型小鼠，其生理特征是多饮、多尿、高血糖，与人类的1型糖尿病症状十分接近，属于自发胰岛素依赖型糖尿病小鼠。NOD小鼠从发病到死亡的时间约为22d，在发病之前，会伴有胰腺炎、胰岛素分泌逐渐减少的症状。NOD小鼠自身免疫性胰岛炎最早于4周龄时发生，患鼠的胰岛会被淋巴细胞浸润形成胰腺炎，进而导致胰岛的萎缩和纤维化。NOD小鼠与人类1型糖尿病有所不同的是，即使没有胰岛素的注射治疗，NOD小鼠也可存活数周，不会因为酮血症而死亡[7]。目前，NOD小鼠主要用于1型糖尿病药物的筛选以及1型糖尿病遗传机制的研究。

1.2.2 BB大鼠 BB大鼠是于1974年由加拿大渥太华Bio-Breeding生物育种实验室发现的，其发病是由于遗传型和自身免疫反应所致。BB大鼠的自身免疫系统如T细胞、B细胞和巨噬细胞会毁坏胰腺β细胞，引起胰腺炎而导致胰岛素分泌缺乏。与NOD小鼠不同的是，BB大鼠会因胰岛素缺乏引发的酮血症而很快死亡，并且CD8+和CD4+淋巴细胞会减少[8]。BB大鼠的临床表现与人类1型糖尿病十分相似，所以BB大鼠作为1型糖尿病模型被广泛使用。

自发性糖尿病动物模型可以很好的模拟出1型糖尿病的临床症状，其遗传性和人类的1型糖尿病十分相似，因此是作为研究干细胞治疗1型糖尿病的理想动物模型。

1.3 病毒感染法诱导1型糖尿病动物模型

病毒可以通过两种方式诱导1型糖尿病的发生：一是病毒直接感染胰腺β细胞，导致胰腺β细胞大面积被破坏，如Kilham大鼠病毒；二是诱导机体产生对胰腺β细胞的免疫反应，从而产生特异性免疫疾病，如脑心肌炎病毒。此外也有研究培育出了转基因动物模型，该模型中胰岛素启动子启动淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lymphocyticchoriomeningitisvirus，LCMV)抗原的表达。此模型小鼠平时不会出现胰腺β细胞被破坏的症状，一旦注射LCMV便会引起小鼠机体内的免疫应答和抗原交叉反应，进而损伤胰腺β细胞，诱发小鼠产生1型糖尿病[9]。

1.4 其他动物模型

目前，对于1型糖尿病动物模型的研究，主要集中于啮齿类动物，但啮齿类成模后的病理特征与人类有着较大差异。不仅如此，对于1型糖尿病的治疗方法，啮齿类动物与人的治疗效果也存在着较大差异，如对于口服胰岛素和烟碱，啮齿类动物可以取得很好的效果，但却不适用于人类。因此，对于小型猪与猴等哺乳动物的1型糖尿病动物模型的研究便孕育而生，通常也使用STZ诱导其产生1型糖尿病。其中，尤卡坦小猪和哥廷根小猪相对其他品种有着实验周期短、血液生化指标与人类相似的优势[10-11]。在所有的动物模型中，与人类的血糖指标、病理特征最为相似的是猴类模型，有报道使用恒河猴成模效果较好[12]。生理上，小型猪与猴的胃肠结构、营养吸收、胰腺发育和形态以及脂质代谢机制与人类相似，尤其值得注意的是猪胰岛素与人类只差一个氨基酸，因此，猪胰岛的异种移植也成为治疗1型糖尿病的方法[13]。但因伦理、实验成本等问题，大型动物试验受到了一定的限制。

2 干细胞对1型糖尿病动物的治疗作用

目前治疗1型糖尿病的主要方法为注射胰岛素使患者消除高血糖的症状，但缺点在于药物治疗具有胰岛素终生依赖性，部分患者存在胰岛素抵抗，胰岛素将糖化的血红蛋白下降的同时也易造成低血糖，并且外源性胰岛素的注射不能有效避免因糖尿病引起的如视网膜病变、心血管病变、肾脏病变等并发症的发生。随着医学的发展，胰岛细胞移植成为治疗1型糖尿病的候选方案，但是该方法存在着供体不足和患者本身的排异反应等问题，因而限制了其广泛应用。近年来，干细胞诱导分化技术的发展和多能干细胞的获得，为1型糖尿病的细胞治疗带来了新的突破口。干细胞具有多向分化的潜能和自我更新能力，理论上可以诱导干细胞分化为胰腺β细胞进而通过移植来修复或者替代原来受损的胰岛。此方法的另一潜在优势在于，可用自体来源的细胞以避免排斥反应。目前可以分化为胰腺β细胞的干细胞有胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、成体干细胞等，成体干细胞主要包括肝干细胞、胰腺干细胞和间充质干细胞等。

2.1 胚胎干细胞

胚胎干细胞被证实可诱导分化为包括胰腺β细胞在内的大多数体细胞。有研究将胚胎干细胞在体外通过转染胰岛素基因的方法，在分化阶段加入烟酰胺获得了具有分泌胰岛素功能的细胞，将该细胞簇移植到STZ小鼠体内，STZ小鼠高血糖的症状得到了一定程度的缓解，但持续时间不长。在此基础上，有研究[14]采用分步定向法诱导小鼠胚胎干细胞，将得到的胰岛样细胞簇移植到STZ小鼠体内，形成了类胰岛组织，小鼠存活期延长。诱导胚胎干细胞向胰腺β细胞分化的过程十分复杂，目前发现通过ActivinA、丁酸钠、Exendin4等诱导因子可以较为高效地获得高纯度和高成熟度的胰岛素分泌细胞。

胚胎干细胞的胰向分化为治疗1型糖尿病提供了希望，其优点在于细胞数量充足，但目前的分化方案所得的胰岛素分泌细胞效率不高，葡萄糖刺激后胰岛素分泌量低，无法实现血糖的生理调节。此外，胚胎干细胞的分化移植仍面临症状反复、免疫排斥、具有成瘤风险等问题。因此，若想投入临床，还需探求更合理的胚胎干细胞诱导因子和诱导分化方案[15-17]。

2.2 诱导多能干细胞

诱导多能干细胞是在特定条件下(如病毒转染外源基因，或者化合物处理等方法)由体细胞获得的具有多项分化潜能的干细胞，具有胚胎干细胞的相关特性和功能。Zhu等[18]将体细胞来源的诱导多能干细胞在体外分化得到的胰岛素生成细胞，移植到1型糖尿病小鼠体内后，可以分泌胰岛素。有学者[19]将恒河猴的诱导多能干细胞在体外诱导分化为具有分泌胰岛素功能的细胞，随后移植到免疫缺陷的1型糖尿病小鼠体内，可以降低小鼠50%的血糖水平。

相较于胚胎干细胞，源于自体的诱导多能干细胞免疫原性低，移植后有望代替胰腺β细胞行使分泌胰岛素的职能。诱导多能干细胞的优势在于可源于自体、免疫原性低、暂无伦理学问题，但还存在重编程机制不清、效率低、变异风险高、多潜能细胞致瘤性等问题，因此广泛应用于临床还为时尚早。

2.3 成体干细胞

成体干细胞是指存在于成年后各组织器官中具有自我更新能力和一定分化潜能的细胞。该类细胞最大的优势在于1型糖尿病患者可通过从自体中分离出成体干细胞，在体外定向诱导分化为具有分泌胰岛素功能的胰腺β细胞，再移植回体内达到长期治疗的目的；相较于胚胎干细胞而言，既克服了由于异体细胞移植而引起的免疫排斥，也避免了相应的伦理问题，成为新的研究热点。

2.3.1 肝干/前体细胞 肝脏与胰腺具有发育同源性，胚胎期均起源于前肠末端[20]。有研究[21]表明肝干细胞可以作为胰腺β细胞替换治疗的一种候选细胞。在肝干细胞向胰腺细胞分化过程中，转录因子胰十二直肠同源基因-1(pancreaticduodenal homeobox-1，PDX-1)是关键的调控基因之一。有研究表明将PDX-1的重组腺病毒转染至小鼠肝前体/干细胞之后，经体外培养可以诱导其分化为分泌胰岛素的β样细胞，诱导后的细胞具有胰腺β细胞的超微结构特征和相关表型，移植到1型糖尿病小鼠模型中可以改善小鼠的高血糖症状。肝干细胞作为候选细胞具有一定应用前景，其优势在于易于扩增以及与胰腺同样起源于内胚层，利于诱导分化。但是肝干细胞目前体外分化效率不高，因此，需要探讨更高效的诱导分化方案。

2.3.2 胰腺干/前体细胞 目前认为胰腺前体细胞分布在胰腺导管上皮细胞、胰腺实质和腺泡内。Smukler等[22]将胰管和胰岛组织中PDX1+/胰岛素+/GLUT2-细胞通过谱系追踪和流式分选相结合的方法，在体外扩增并诱导分化为胰腺β细胞，移植后改善了STZ小鼠高血糖症状。也有研究[23]利用PDX1、NGN3(neurogenin3)和巨噬细胞激活因子A(macrophageactivating factorA，MafA)将胰腺中外分泌细胞转分化成胰岛素分泌细胞，移植后也可减轻糖尿病动物模型高血糖的症状。胰腺干/前体细胞目前面临的问题是存在部位不明确、所得量稀少以及缺乏有效的体外扩增方法。

2.3.3 间充质干细胞 间充质干细胞具有多向分化潜能，取材方便且分布广泛，可以来源于脂肪、脐带、脐血、骨髓等。Neshati等[24]将人骨髓间充质干细胞移植到1型糖尿病小鼠中，可以长期稳定的改善小鼠高血糖症状。但有研究发现移植人骨髓干细胞的小鼠胰腺组织中并未发现源于人骨髓间充质干细胞的胰岛样细胞，因此认为间充质干细胞并不是直接分化为分泌胰岛素的细胞，而是迁移到胰岛后，骨髓间充质干细胞可以刺激胰腺β细胞的再生，调节全身免疫反应，通过抑制T细胞的增殖，保护胰腺β细胞免受T淋巴细胞的破坏。间充质干细胞可以分泌细胞因子来修复受伤组织，改善胰腺β细胞的生存微环境[25-26]。此外，间充质干细胞还可以用于改善1型糖尿病的并发症，如糖尿病肾病。Lee等[27]将人骨髓间充质干细胞经左心房注射入STZ小鼠，可在肾小球中检测到人源性CD31阳性细胞，可以判断骨髓间充质干细胞归巢到肾脏分化形成了内皮细胞，起到保护肾小球的作用。间充质干细胞治疗1型糖尿病有着很大的前景，其优点在于来源广泛、自体移植免疫排斥小，但也有一些潜在问题，如诱导分化的效率不高、机制不明、有成瘤性的危险等。

3 展望

合适的1型糖尿病动物模型对于评价干细胞分化得到的胰腺β细胞有着重要的作用。啮齿类动物虽然造模容易、数据重复性较高且成本相对较低，但是不能完全模拟人1型糖尿病临床症状，因此无法正确评价干细胞的治疗效果。小型猪和猴的1型糖尿病模型是目前评价干细胞是否有治疗效果的理想模型。综上来看，不同来源的干细胞向胰腺β细胞分化是可行的，这为细胞替代法治疗1型糖尿病拓宽了方向。由于干细胞来源的不同，分化方法的差异，不同干细胞得到的胰腺β细胞状态和功能不尽相同，所获得的胰腺β细胞在体内是否能分泌足够的胰岛素以及是否能响应血糖的动态变化来满足机体长期的需求还有待探索。