胃癌干细胞的研究进展△

申杰，李媛，徐桂华#

内蒙古自治区人民医院1神经内科，2科研处对外合作与成果管理科，呼和浩特010017

胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，也是导致恶性肿瘤患者死亡的第三大原因[1]。目前多学科联合治疗能够改善晚期胃癌患者的预后[2]，虽然治疗方面取得了很大的进步，但胃癌患者的预后仍然较差，5年生存率仍低于40%，主要原因是其具有频繁复发、易转移和强耐药性的特点[3]。因此，研究胃癌频繁复发、转移和耐药的关键机制非常重要。胃癌的耐药、转移和复发可能是由于胃癌干细胞（gastric cancer stem cell，GCSC）的存在[4]。有研究指出，在胃癌中CD44与CD133表达上调与多种临床特征及不良预后相关，在胃癌患者中联合检测CD44和CD133对疾病诊断、预测预后方面具有重要作用[5]。除此之外，干细胞相关基因也可以作为胃癌的预后标志物。其中，miRNA-501-5p对于维持GCSC的干性至关重要，还与胃癌患者的生存率呈负相关，说明miRNA-501-5p也可作为预后的预测因子[6]。部分临床前研究提出通过抑制干细胞相关基因的表达能够靶向治疗GCSC，这可能为其临床应用奠定理论基础，为胃癌新的预后标志物和有效的治疗策略提供了参考。本文主要总结目前关于GCSC的调控机制，有助于系统地了解GCSC，以期为胃癌发生机制的研究奠定基础。

1 GCSC的分离与鉴定

GCSC的分离、鉴定是研究其潜在机制和功能的关键。多项研究表明，在添加生长因子的无血清悬浮培养基中，肿瘤干细胞可以形成球状细胞，保持自我更新特性。这些细胞具有无限增殖、自我更新的特性，并有相关基因表达增加，如CD44、八聚体结合转录因子4（octamer-binding transcription factor 4，Oct4）、性别决定区Y-box转录因子2（sex determining region Y-box transcription factor 2，SOX2）、ATP结合亚族G成员2（ATP binding cassette subfamily G member 2，ABCG2）、NANOG 等[7-8]，因此成球实验被认为是获得GCSC的一种简便方法。然而由于缺乏微环境的刺激，在成球过程中干细胞的特性可能发生改变。利用Hoechst 33342标记GCSC，能够通过流式细胞仪从侧群细胞（side population cell，SP）中富集 GCSC[9]。胃癌细胞中的SP对5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）和多柔比星具有较强的耐受能力，移植到免疫缺陷的NOG小鼠后，产生肿瘤的能力增强[10]。但由于Hoechst 33342对细胞有毒性，可能会对实验的准确性造成一定的影响。研究发现利用长春新碱处理胃癌细胞能够显著增加肿瘤球形成能力，并使干细胞相关基因的表达增加，如CD44、SOX2、Oct4和Musashi-1，这表明长春新碱处理也可用于富集GCSC[11]。

尽管GCSC分离标志物的特异性存在争议，但越来越多的证据表明这些标志物也能用来富集GCSC。CD44是第一个被发现的GCSC表面标志物，在肿瘤细胞对微环境的反应中起着关键作用。研究发现，SCID小鼠被注射（2～3）×104个CD44阳性胃癌细胞8～12周后，在皮肤和胃均能产生肿瘤；而注射（3～10）×104个CD44阴性胃癌细胞则不能产生肿瘤，表明CD44阳性胃癌细胞具有强致瘤性。此外，CD44阳性胃癌细胞还表现出较强的肿瘤球形成能力、耐化疗能力和耐辐射能力[12-13]。同时表达CD44/CD24可用于富集胃癌中的GCSC[14]，与CD44/CD24均为阴性的细胞相比，CD44/CD24均为阳性的肿瘤细胞具有自我更新、增殖和肿瘤易复发的能力。从外周血中分离出的CD44/CD54均为阳性的细胞自我更新能力增强，表明CD44/CD54均为阳性的细胞可用于肿瘤组织及外周血中GCSC的鉴定[15]。RNA结合蛋白Musashi-1在维持干细胞未分化状态中发挥着重要作用[16]。并且CD44/Musashi-1也可作为富集GCSC的表面标志物，研究发现CD44/Musashi-1均为阳性的胃癌细胞的增殖、自我更新能力和耐药性均有所提高[17]。上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）结合CD44也可用于富集GCSC[18]。其他一些分子如CD90、CD71和富含亮氨酸重复序列G蛋白偶联受体5（leucine rich repeat containing G protein-coupled receptor 5，LGR5），也被报道具有成为GCSC候选表面标志物的潜力[4,19-20]。

2 编码蛋白质的基因对GCSC干性的调控

GCSC中一些异常表达的信使RNA（messenger RNA，mRNA）和蛋白质在维持GCSC中发挥着重要作用。磷酸化的细胞外信号调节激酶（phosphoryhted-extracellular signal-regulated kinase，p-ERK）介导GCSC中CD44和Oct4正反馈回路，参与维持胃癌细胞的干细胞特性，如耐药性、高致瘤性和转移能力。同时，通过选择性mRNA剪接产生的CD44变异体（CD44 variant，CD44v）也有助于维持胃癌细胞的干细胞特性。xCT是谷氨酸-胱氨酸交换转运体的轻链亚基，通过参与胱氨酸摄取和谷胱甘肽合成，在细胞内氧化还原平衡中发挥重要作用。CD44v可以与xCT相互作用，增加细胞内谷胱甘肽含量，进而增加胃癌细胞对氧化应激的抵抗力[21]。在临床研究中发现晚期胃癌患者接受xCT抑制剂柳氮磺胺吡啶治疗后，阳性表达CD44v的干细胞比例降低，提示柳氮磺胺吡啶联合化疗可能改善胃癌患者的预后。另一种与干细胞相关的SOX2在GCSC中表达增加，对肿瘤球形成能力和多柔比星抗性有显著作用[22]。干细胞相关基因BMI1在SGC7901和MKN45细胞系的球形细胞中过表达，且BMI1与Oct4、SOX2、NANOG、CD44、CD133等多种干细胞标志物表达呈正相关。BMI1能够通过蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称 AKT）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路介导miRNA-21的激活，对干细胞干性有正向调控作用[23]。

许多研究已经明确了经典的干细胞相关信号通路在GCSC中具有调节作用。WNT/β-catenin通路在维持干细胞特性中的重要作用受到越来越多的关注[24]。据报道，溶质载体家族34成员2（solute carrier family 34 member 2，SLC34A2）可诱导激活WNT/β-catenin信号，以及增强CD44阳性GCSC的自我更新和耐药能力。进一步研究显示，SLC34A2通过结合miRNA-25启动子区域能上调miRNA-25的表达，从而抑制糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase 3β，GSK3β）表达，激活WNT/βcatenin信号通路[25]。有研究发现，在CD44阳性胃癌细胞中Notch1信号通路被激活。γ-分泌酶能抑制Notch1的自我更新、肿瘤发生和CD44阳性胃癌细胞的迁移能力以及化疗耐药性，表明Notch1信号对GCSC至关重要[26]。

3 非编码RNA对GCSC干性的调控

非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）大致分为两类：小于等于200个核苷酸的小RNA和大于200个核苷酸的长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）。越来越多的证据显示，微小RNA（microRNA，miRNA）在GCSC中具有调控功能。通过miRNA微阵列分析发现，MKN-5细胞通过流式细胞仪分选出SP与其他细胞之间的miRNA表达模式存在差异[27]。球状体形成细胞与MKN-5细胞系的亲本细胞miRNA表达模式也有显著差异。这些miRNA与调控多能性的信号通路有关，如转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）/SMAD、WNT/β-catenin 和 Notch 信号通路[28-29]。因此，miRNA表达活性也参与调控GCSC干细胞特性的调控。

miRNA-196-5p能调控CD44阳性GCSC的活性，其调控机制为直接抑制3'-UTR SMAD4表达从而增强CD44阳性GCSC的自我更新能力[30]。与此同时，miRNA-106b通过激活TGF-β/SMAD信号通路，能够使GCSC维持干细胞特性[29]。报道称一些miRNA可能通过WNT/β-catenin途径对GCSC的特性起到调控作用。例如，miRNA-483-5p通过激活WNT/β-catenin信号通路可以促进GCSC生长和自我更新[31]。miRNA-501-5p通过直接下调Dickkopf相关蛋白1（dickkopf WNT signaling pathway inhibitor 1，DKK1）、WNT信号通路NKD抑制剂（NKD inhibitor of WNT signaling pathway 1，NKD1）、GSK3β表达激活WNT/β-catenin信号通路，有助于增强GCSC的干细胞特性[6]。在CD44/EPCAM均为阳性的胃癌细胞的成球过程中，miRNA-19b、miRNA-92a、miRNA-20a表达逐渐下降。miRNA-19b、miRNA-92a、miRNA-20a可显著增强GCSC的耐药性、自我更新能力和致瘤性，其机制推测为miRNA-19b、miRNA-92a、miRNA-20a可直接抑制WNT通路的阻滞剂E2F转录因子1（E2F transcription factor 1，E2F1）和同源域相互作用蛋白激酶1（homeodomain interacting protein kinase 1，HIPK1），进而激活WNT/β-catenin信号通路。通过分析97例胃癌患者胃癌组织中的miRNA-92a表达水平发现，miRNA-92a可作为胃癌的预后因子[32-33]。同时，miRNA也可以调控Notch信号通路，进一步调控GCSC的多能性。

N2IC是Notch2受体的活化形式，其通过上调环氧化酶-2导致胃癌发生[34]。研究发现，GCSC中N2IC、ETS原癌基因1（ETS proto-oncogene 1，ETS1）、miRNA-23b的负反馈通路，在调控GCSC多能性中发挥重要作用[35]。通过沉默N2IC、ETS1，可抑制肿瘤球形成能力，并使CD44、Nanog、SOX2等干性基因的表达降低。过表达N2IC和ETS1可能起到相反的作用，刺激E2F1的表达，进而抑制miRNA-23b的表达。并且研究发现ABCG2通过SP调控维持干细胞特性，促进胃癌耐药性[36]。miRNA-132可以增强LGR5阳性GCSC患者对顺铂的耐药性，可以直接抑制SIRT1的表达维持CERB的活化，最后导致ABCG2的表达水平增加[5]。

lncRNA作为ncRNA的一员，通过与DNA、RNA、蛋白相互作用调控染色质重叠、选择性剪接和转录机制，以顺式或反式的方式调控基因表达[37]。有研究发现lncRNA调控蛋白在GCSC中具有调控作用[38]。在CD133阳性的GCSC中过表达lncRNA调控蛋白，能促进GCSC的增殖和侵袭，同时可上调Oct4、SOX2、NANOG等多能基因的表达。

4 GCSC的临床研究进展

胃癌频繁复发可能主要是由于对非GCSC抗肿瘤治疗引起的[39]。由于GCSC在耐药性和肿瘤转移中的作用，针对维持肿瘤干细胞关键靶分子的治疗可以改善胃癌患者预后[40]。目前提出几种关于干性相关基因的靶向疗法用于特异性消除GCSC。

纳米技术具有在特定部位装载诊断和治疗化合物的能力，有助于肿瘤预防、诊断和治疗[41-42]。CD44在GCSC中具有重要作用，利用抗体引导CD44靶向治疗也是种有效的抗肿瘤策略。在Ⅰ期临床试验中测试了几种CD44v6-特异性抗体，均具有良好的肿瘤靶向治疗效果[43-44]。合成的纳米探针GNS-PEG-CD44v6通过干扰CD44的功能，诱导CD44阳性细胞介导的GCSC清除，进一步调控肿瘤形成。在小鼠皮下注射GNS-PEG-CD44v6标记的GCSC细胞，照射红外激光两周后发现，肿瘤体积减小，表明该探针在GCSC靶向治疗中的潜在应用[45]。

RNA干扰诱导小分子工具正在开发中，用于抑制干细胞相关基因的表达。miRNA-34a通常在肿瘤组织中表达下调，是CD44的负调控因子[46]。纳米囊泡介导的PLI/miRNA-34a通过纳米级稳定的miRNA-34a递送系统靶向GCSC，在体内显著抑制CD44表达，并诱导肿瘤细胞凋亡，具有良好的抗肿瘤作用[47]。联合应用核酸和抗肿瘤药物也是减少肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞数目的有效方法。含有miRNA-200c和多西紫杉醇（docetaxel，DOC）的稳定凝胶刺激纳米颗粒具有较好的肿瘤细胞靶向能力和协同抗肿瘤作用。研究发现miRNA-200c/DOC纳米颗粒可以改善E-钙黏蛋白表达，降低CD44表达，降低肿瘤形成能力[48]。

此外，分化治疗也是种有效抑制肿瘤干细胞增殖的方法。无调性bHLH转录因子1（atonal bHLH transcription factor 1，ATOH1）是一种基本的螺旋-环-螺旋转录因子，在诱导肠上皮细胞分化中起重要作用[49]。GCSC中ATOH1的过表达能够降低干性基因的表达水平，同时增加各种分化标志物的表达，进而降低体外GCSC的成球能力以及体内肿瘤形成能力[50]。这表明ATOH1可作为分化疗法用于根除GCSC。全反式维甲酸（alltrans retinoic acid，ATRA）被证明可有效诱导GCSC的分化，表现为胃上皮分化标志物的表达增加，如细胞角蛋白、黏蛋白6（mucins 6，MUC6）和三叶肽因子3（trefoil factor 3，TFF3）；并且治疗后肿瘤球中干细胞相关基因表达下调。ATRA预处理的肿瘤球注射到免疫缺陷小鼠体内，不会产生肿瘤；当用33 μmol/kg ATRA处理后注射，可明显抑制肿瘤生长。说明ATRA可诱导GCSC分化，消除GCSC[51]。

5 小结与展望

目前在GCSC所涉及的分子调控机制方面已经取得了很大的成就。干细胞相关的mRNA、蛋白和ncRNA在干细胞特性调控中发挥着重要作用，有望成为胃癌患者预后标志物或特异性靶点。越来越多的证据表明GCSC在耐药、肿瘤转移和复发中起着关键作用[52-53]。干细胞相关基因可能对肿瘤干细胞发展有帮助，也可能与胃癌患者的不良预后密切相关。这也表明GCSC在胃癌中的重要性，靶向清除GCSC可能是提高恶性肿瘤患者预后的最有效方法。分化疗法、纳米技术和基于当代表观遗传工具的疗法，在抑制GCSC方面具有应用前景。未来需要进一步评估其体内效应，确定其是否可以改善胃癌患者的预后。为了实现GCSC靶向治疗在临床中的应用，仍有许多工作要做。此外，正常干细胞与GCSC有一些共同的干性相关基因，如何在不影响正常组织干细胞的情况下选择性靶向GCSC仍然是一个很大的难题，有待进一步研究。