诱导性多潜能干细胞成骨分化的研究进展

贺旭峰 娄向新 朱华锋 张慧敏

[摘要] 诱导性多潜能干细胞（iPS Cell）是一种经人工诱导重新编程后产生的多潜能分化干细胞。目前，iPS细胞已成功再分化为多种不同的成熟细胞，其中包括成骨细胞。因此，利用iPS细胞诱导成骨以治疗骨组织疾病成为一个可期待的选择。本文回顾了iPS细胞成骨分化的体内外研究成果;除此之外，讨论了细胞因子及微小RNA（miRNA）对iPS细胞成骨分化的作用;最后，综述了各类支架对于iPS细胞成骨作用的影响，并分析了相关优缺点，以期为进一步实验及研究提供参考。

[关键词] 诱导性多潜能干细胞;成骨分化;骨重建;成骨细胞

[中图分类号] R329          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）01（a）-0049-04

诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell， iPS cell）由日本京都大学Yamanaka研究小组于2006年率先成功制备，他们利用逆转录病毒，将Oct3/4、Klf4、Sox2和c-Myc基因转入小鼠胚胎成纤维细胞内，成功将体细胞重编程为具有多种分化能力的干细胞。2007年该小组将人类的成纤维细胞诱导为iPS细胞[1]。iPS细胞有着与胚胎干细胞相似的分化能力，目前iPS细胞已成功地被分化为多种特异性细胞，相关细胞研究涉及帕金森病[2]、糖尿病[3]、肌萎缩侧索硬化症[4]、血友病[5]、阿尔茨海默病[6]、牙釉细胞分化[7]等多个方面。iPS细胞的出现对于组织工程及干细胞研究具有划时代的意义。

虽然骨组织具有一定的再生能力，但骨缺损及骨不连仍是各种骨折后出现的较难处理的临床问题。据统计，有5%～10%的骨折后患者均会出现不同程度的骨缺损及骨不连[8]。临床异体植骨有着免疫排斥的问题，自体移植也有诸如二次创伤及高并发症等限制，于是将iPS细胞诱导成骨进行治疗成为一个可期待的选择。目前已有一些相关研究，现综述如下：

1 iPS细胞的成骨分化体外实验研究

近年来，越来越多人或鼠类iPS细胞成骨分化研究出现，替代原先只有胚胎干细胞的情况[9]。基于既往胚胎干细胞技术，很多研究利用同样的技术试图将iPS细胞分化为成骨细胞[10-11]，并取得成功。

Okamoto等[12]利用含有10%胎牛血清（FBS）等成分的培养液培养小鼠iPS细胞，通过生成胚胎小体（EB）细胞随后成骨细胞分化，将EB细胞置于含有明胶涂层的培养皿，利用含有地塞米松的培养液培养进行体外成骨细胞分化。另有研究利用未分化的iPS细胞，用缓冲液去除滋养层细胞，然后于培养皿中培养。在EB细胞形成后，将EB细胞播种到培养皿上 ，培养5 d后，将形成的细胞利用过滤器过滤，并培养在诱导成骨液中，进行成骨分化[13] 。Tashiro 等[14]通过悬滴法培养获得EB细胞，将EB细胞转移到培养液，培养皿中悬浮培养3 d，然后在分化培养液中再培养2 d，接着细胞经过载体转导，然后在含有明胶涂层培养皿中培养，最后在成骨分化液中体外成骨分化。

由于体外iPS细胞培养技术的渐渐成熟，有研究不仅探索了成骨尝试，并进行了相关成骨检验和定量。Li等[15]用不同来源生长因子处理的iPS细胞，并对其进行消化处理，然后在成骨分化培养液中培养孵化28 d后，用茜红素染色观察定量矿化的程度。Kao等[16]将iPS细胞放在含有FBS、维生素C等成分的培养基中成骨诱导，得到的细胞用PBS冲洗然后固定，最后通过冯库萨染色和茜红素染色评估成骨分化。

另外，胚胎干细胞及iPS细胞分化为骨细胞的技术同样适用于间充质干细胞[17]。Deyle等[18]通过iPS细胞生成EB细胞，在培养液中培养，由此生成的间充质干细胞（iMSC）诱导为成骨细胞，进行体外成骨分化，表达碱性磷酸酶、RUNX2以及成骨细胞特有的基因骨钙素，同时体外生成矿物质。最后利用茜红素染色确定钙的存在。

從体外成骨实验可以发现，iPS细胞转化成骨所利用的成骨因子借鉴了之前胚胎干细胞的实验经验，基本沿袭了相似的成骨因子（如地塞米松、维生素C等）。再者鲜有iPS细胞体外直接进行成骨诱导分化，大多先将iPS细胞诱导培养为EB细胞，或者将其培养为间充质干细胞，再进行成骨诱导。结合笔者经验，这很可能与iPS细胞直接诱导成骨的成功率较低有关。

2 iPS细胞的成骨分化体内实验研究

近年来，有研究进一步尝试了体内植入iPS细胞，使其分化为骨组织[19]，该研究显示人iPS细胞可在裸鼠实验中分化为牙周类骨组织，他们将iPS细胞移植入鼠类牙槽中，结合牙釉基质蛋白复合体，最终形成牙骨质。

体内iPS细胞的研究除了将细胞直接植入外，很多研究均将细胞与一些介质或支架相结合进行体内植入。比如利用羟基磷灰石/磷酸钙基质与iPS细胞所分化的间充质干细胞相结合，一起移植到免疫缺陷小鼠身上，8周后取出进行研究[18]。Ye等[20]利用丝纤蛋白支架结合iPS细胞进行体内实验。进行细胞消化后，将iPS细胞吸移悬浮在丝纤蛋白支架上，含有iPS细胞的丝纤蛋白支架经孵化后将iPS细胞与丝素蛋白三维支架复合体置入颅骨缺损裸鼠模型的颅骨缺损处，观察其成骨情况。

还有利用明胶海绵作为支架进行体内成骨的报道，将明胶海绵浸润在成骨分化液中，iPS细胞所分化的成骨细胞加入明胶海绵，在小鼠背部纵向切开切口，将带有已分化成骨细胞的明胶海绵植入切口中缝合，分批培养观察成骨情况[21]。

此外有报道将iPS细胞诱导所产生的细胞播种于HA/TCP陶瓷支架上，在37℃孵化2 h，确保细胞黏附在陶瓷上。再将带有细胞的陶瓷支架移植到联合免疫缺陷小鼠背部皮下，移植5周后，处死小鼠取出陶瓷支架以研究成骨情况[15]。这项研究已非常接近临床实用情况。

通过iPS细胞体内成骨实验可以发现，为了避免免疫反应，大多利用裸鼠进行研究。植入部位有的选择直接注入皮下，有的则放于骨缺损部位。很明显，后者研究更具有临床意义，也是目前研究方向之一。另外，有的实验选用所分化细胞直接植入体内，也有结合支架及介质植入体内研究。目前报道显示，细胞结合支架的成骨效果明显好于单纯细胞植入。

除此之外，Polo等[22]研究表明，不同来源诱导的iPS细胞，其基因表达会有不同，与其来源有关，不同来源的iPS细胞似乎仍有与来源相关的“转录记忆”。因此，基因重编程及表观遗传编程机制仍需更深入的研究。当然，来源于骨髓间充质干细胞的iPS细胞，其成骨作用已被证实[13]。因此，我们可以选择不同来源的iPS细胞以选择最优的分化方向，但相关机制仍需进一步深入研究。

3 细胞因子及微小RNA在iPS细胞成骨分化中的作用

在干细胞成骨诱导过程中，比较基本的成骨介质为胎牛血清、维生素C、甘油磷酸酯以及地塞米松[23-24]。其他促进因素包括骨形成蛋白（BMP）[9]及维生素D3[25]。有报道显示BMP在干细胞分化中有着重要的作用[26]。尤其是BMP-2，研究表明在一定条件下对于干细胞的成骨及成软骨过程有极强的作用[27]。最近一项进展显示，白藜芦醇可以促进iPS细胞及胚胎干细胞的成骨分化。实验中将细胞注射到裸鼠背部皮下组织，观察和测量体内成骨情况。实验显示，在糖皮质激素环境下诱导的iPS细胞成骨实验中，白藜芦醇可促进iPS细胞分化为类骨细胞，并减少激素对细胞的氧化损伤，减少畸胎瘤的发生率[16]。

许多研究表明，iPS细胞与胚胎干细胞分化时，对各种因子的反应是有所不同的，同时也报道了将iPS细胞定向到特定细胞的方法[28]。其中，体内实验显示转化生长因子（TGF）-β家族可增强成骨效应及骨重建，Li等[15]的研究揭示了TGF-β1和TGF-β3结合维A酸，能在体外实验中更好地使iPS细胞进入“间充质状态”，促使其成骨分化。另一项研究则显示仅用维A酸也可促进鼠类iPS细胞的成骨分化与增殖[21]。所有这些体内外实验均说明TGF-β家族至少能促进鼠类iPS细胞向成骨细胞分化。

在iPS细胞实验中，利用腺病毒转导有成骨表达功能的细胞因子Runx2，可加强iPS细胞成骨分化。结果显示，经Runx2转换组的ALP的表达是无Runx2组的2倍，钙沉积是其8倍[14]。

还有一些其他控制成骨表达的因素，比如微小RNA（miRNA）技术。近期研究表明miRNA在众多细胞分化中有着作用[29]，以及多种miRNA在干细胞成骨分化中有着重要的作用[30]。Okamoto等[12]确定了6种成骨相关miRNA，包括miR-124a、miR-181a、miR-10a、miR-10b、miR-9-3p、miR-19b，并归纳了这些miRNA在鼠iPS细胞成骨过程中的具体作用。他们发现BMP-4诱导的成骨与常规成骨通路中miRNA抑制调控有关，在这过程中，6种miRNA对控制BMP-4诱导的iPS细胞成骨过程有着重要作用。在以后的研究中，基因治疗及应用需要更多数据，以证实其有效性及安全性。鉴于已有的临床应用，BMP2/4及Runx2显得更具研究潜力[31]。

4 支架在iPS细胞成骨分化的作用

细胞外基质对于维持细胞功能和结构有着重要作用。组织工程就是要建立合适的3D支架来模拟细胞外基质，使其维持细胞生长及细胞分化。有报道显示通过在胚胎小体细胞培养皿中放入聚醚砜纳米纤维支架及成骨分化液进行培养，成功进行体外成骨分化[32]。与此同时各种材料支架均有文献报道对iPS细胞成骨分化有着促进作用。

一些骨缺损动物模型研究将iPS细胞移入生物工程支架以加强骨组织重建再生，在实验中，当iPS细胞移植入免疫缺陷小鼠模型后，这些细胞分裂增殖并形成骨组织[21]。Jin等[33]利用聚己内酯3D支架结合人iPS细胞成功进行了成骨分化，实验中iPS细胞支架联合体的成骨作用增强并有顯著差异，这显示以基于iPS细胞的组织工程支架来治疗骨缺损是一个可能的有效方法。尤为重要的是，在iPS细胞置入并逐渐诱导成骨进行到8周，在成骨部位未发现畸胎瘤组织。这篇报道提示了由iPS细胞诱导成骨治疗骨缺损是有效及安全的。

同时，现有体内外实验均显示与支架相结合，iPS细胞成骨表达均有增加，体内天然的成骨细胞外基质机构均为纳米级，相应的细胞和组织则高度依赖其机构状态[34]。近年研究表明iPS细胞和纳米纤维支架结合有着良好的成骨效果，纳米支架渐成替代细胞外基质促进成骨分化的选项之一。

静电纺丝技术为大规模制造纳米级聚合物支架以及组织工程学提供了重要的技术支持[35]。静电纺丝技术可以任意选择所需要的组织材料，为目标细胞提供最优的模拟细胞外基质。D′Angelo等[36]利用聚乳酸-羟磷灰石纳米支架进行iPS细胞分化为间充质细胞及成骨细胞的实验，体内外实验均显示了稳定的成骨分化及增殖。

从目前支架方面研究笔者认为除了体外实验，需加强研究体内环境对于支架影响iPS细胞分化的作用;另外，各种不同类型支架包括纳米支架均对iPS细胞成骨分化有作用或是增强作用，他们之间的差别有待探讨。之后的实验应扩展至多种细胞包括胚胎干细胞及间充质干细胞等，以探究对骨缺损的治疗，并探讨及确定相关标准及条件。

综上所述，虽然目前iPS细胞研究较多，也有一些令人鼓舞的成果，但要使得应用iPS细胞成骨分化进行骨缺损治疗成为一种可靠的方法，仍然一些需要解决的问题：①iPS细胞是否有同胚胎干细胞一样，有着持续的表达能力;②体内植入iPS细胞是否会形成畸胎瘤[37]，在诱导其成骨分化时，又要抑制其成为畸胎瘤;③iPS细胞进行分化及代谢的外环境的维持。因此仍有很长一段路需要研究人员艰苦探索，iPS细胞研究尚有巨大潜力有待挖掘。

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（收稿日期：2018-05-08  本文編辑：金   虹）