水蒸气蒸馏法提取八角茴香油及其抑菌活性研究

李萍 汪青青 赵鹏英 周坤

摘    要：为优化八角茴香油的提取工艺并开发其作为植物源抗菌剂应用于农业和食品保鲜领域，试验采用水蒸气蒸馏法提取八角茴香油，以提取率为评价指标，通过单因素试验筛选最佳萃取溶剂，并确定提取前物料粉末浸泡时间，利用单因素试验结合L9（34）正交试验筛选料液比、蒸馏时间和物料粉碎度的最优组合，并通过滤纸片法测定八角茴香油抑菌活性。结果表明，八角茴香油最佳提取工艺条件为料液比1∶20 g·mL-1，水蒸气蒸馏时间50 min，八角果实粉碎度0.30～0.45 mm（筛孔径），以石油醚（30～60 ℃）作为萃取溶剂，提取前将八角茴香粉末浸泡36 h，在此条件下八角茴香油提取率可达14.657%。八角茴香油对枯草芽孢杆菌的抑制效果优于大肠杆菌，其抑菌活性随着八角茴香油浓度的增加而增大;八角茴香挥发性成分的油相部分（八角茴香油）抑菌效果优于水溶性组分，但浓度为1 000.0 mg·mL-1的水溶性组分对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌仍然具有中度敏感的抑制效果，因此，应综合利用八角茴香挥发性成分（八角茴香油和水溶性组分）。

关键词：八角茴香油;水蒸气蒸馏法;提取工艺优化;抑菌活性

中图分类号：Q946.85， O658.3      文献标识码：A      DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.02.002

Abstract： In order to optimize the extraction process of star anise oil and develop it as a plant-derived antibacterial agent for agricultural and food preservation， hydro-distillation method was carried out to extract star anise oil. According to the single factor test， using the extraction rate as an evaluation index， the best extraction solvent was screened， and the soaking time of the material powder before extraction was determined. The optimum combination of material-liquid ratio， hydro-distillation time and powder granularity of the material were screened by single factor test combined with L9（34） orthogonal test， the antibacterial activity was determined by the method of agar disc diffusion. The results showed that the optimum extraction conditions were as follows： ratio of material to distilled water was 1∶20 g·mL-1， hydro-distillation time was 50 min， powder granularity of the material was 0.30～0.45 mm， the star anise powder was presoaked 36 h， petroleum ether （30～60 °C） as the extraction solvent and under these conditions the extraction rate could reach 14.657%. The inhibitory effect of star anise oil on Bacillus subtilis was better than that of Escherichia coli， and the antibacterial effect increased with the concentration of star anise oil. Though the antibacterial effect of oil phase of the volatile constituents of the star anise（e.g. star anise oil） was better than the water-soluble components， the water-soluble components with a concentration of 1 000.0 mg·mL-1 still showed moderate inhibition effect against E. coli and B. subtilis. Therefore， the volatile constituents of star anise （star anise oil and water-soluble components） should be used in combination.

Key words：  star anise oil; hydro-distillation; optimization of extraction process; antibacterial activity

植物精油具有抗菌活性，被作為防腐剂应用广泛，其中，八角茴香油是从八角茴香的果实、枝、叶等部位提取得到的组成复杂的混合物，具有杀菌、杀虫、抗氧化等生物活性[1-3]，在医药、食品、农业领域应用广泛。提取方法不同，所得八角茴香油外观品质、化学组成和生物活性存在较大差异[4]。索氏[5]和超声波法[6]提取，需要大量的有机溶剂且能耗较大，所得八角茴香油呈树脂状态，颜色较深，外观品质较差;超临界流体法萃取的八角茴香油外观品质较好，但设备昂贵，操作成本高，难以实现工业化生产[7];水蒸气蒸馏法提取的八角茴香油为无色至浅黄色澄清液体，外观品质好，常用于医药、食品保鲜和农业领域[8]。

本研究采用水蒸气蒸馏法提取八角茴香油，利用正交试验优化提取工艺，采用滤纸片法研究八角茴香油的抑菌活性，为开发利用八角茴香油作为植物源抗菌剂用于农业和食品保鲜领域提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料与菌种

大红八角：产地广西，购于超市，室温下阴干2周，粉碎，过筛，备用。

供试菌种：大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，由天津农学院农学与资源环境学院微生物实验室提供，4 ℃斜面保存，用前活化2次。细菌用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。

正己烷、环己烷、石油醚（30～60 ℃）、乙酸乙酯、无水乙醇、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、氯化钠、无水硫酸钠均为国产分析纯。

1.2 试验仪器与设备

DX-35BI型立式压力蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司;Thermo Scientific MSC-AdvantageⅡ级生物安全柜：德国Thermo Fisher Scientific公司;LRH-250-S型恒温恒湿培养箱：广东省医疗器械厂。

1.3 试验方法

1.3.1    八角茴香挥发性成分的油相组分提取    称取10 g（准确至0.000 1 g）八角茴香粉末置于500 mL 圆底烧瓶中，按一定的料液比加入蒸馏水，安装好水蒸气蒸馏装置，加热蒸馏一定时间，收集馏出液（油水混合物），盐析，转入分液漏斗，有机溶剂萃取2次（每次15 mL），合并有机溶剂层，无水硫酸钠干燥1 h，过滤，蒸除溶剂，得八角茴香挥发性成分的油相组分（即八角茴香油），称重，计算提取率。

1.3.2 八角茴香油提取的试验设计 通过单因素试验考察萃取溶剂、物料粉末浸泡时间、料液比、蒸馏时间和物料粉碎度对八角茴香油提取效果的影响。在此基础上，以提取率为评价指标，对料液比、蒸馏时间和物料粉碎度用L9（34）正交试验优化提取工艺。

1.3.3 八角茴香挥发性成分的水溶性组分提取[9]    从水蒸气蒸馏提取八角茴香挥发性成分的油相组分的馏出液恰好变澄清开始，更换接收瓶，继续收集馏出液，至圆底烧瓶内的液体几乎蒸干，所得馏出液盐析，转入分液漏斗，有机溶剂萃取2次（每次15 mL），合并有机溶剂层，无水硫酸钠干燥1 h，过滤，蒸除溶剂，得八角茴香挥发性成分的水溶性组分。

1.3.4 抑菌活性测定 供试样品溶液的配制：八角茴香挥发性成分的油相组分（八角茴香油）和水溶性组分，初始浓度均为1 000.0 mg·mL-1，用DMF作溶剂，采用2倍连续稀释法配成一系列不同浓度的供试样品溶液。

菌悬液的制备：将斜面活化好的细菌接入液体培养基，37 ℃摇床培养18 h，用平板计数法测定菌落数[10]。无菌水稀释，制成含菌数为107 cfu·mL-1的菌悬液。

抑菌活性测定：采用滤纸片法测定[11-12]。取6 mm的滤纸片，紫外灭菌0.5 h后，浸入不同浓度的八角茴香挥发性成分的油相组分和水溶性组分供试样品溶液中，备用。灭菌培养基冷至50 ℃，倒入培养皿中（直径9 cm），每皿20 mL，固化45 min。将200 μL菌悬液均匀涂布在固体培养基上，制成含菌平板。取浸泡不同浓度待测样品溶液的滤纸片贴在含菌平板上，每皿均匀贴3片，DMF作空白对照，每个浓度重复3次，倒置培养法37 ℃培养24 h。以十字交叉法测量抑菌圈直径，结果用平均值±标准差表示，单位mm。

1.4 数据处理和统计分析

采用origin 8.5制圖，SPSS statistics 22.0进行数据处理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 水蒸气蒸馏后萃取八角茴香油溶剂的选择

由表1可知，溶剂对八角茴香油萃取得率顺序为：无水乙醇>乙酸乙酯>石油醚>环己烷>正己烷。无水乙醇和乙酸乙酯分别为极性和中等极性溶剂，萃取八角茴香油得率较高，但产品均为红褐色液体，外观品质较差，静置后有沉淀物，说明所得八角茴香油中杂质较多，且两种溶剂沸点相对较高，蒸除时能耗较大。石油醚、正己烷和环己烷均属于非极性溶剂，其中石油醚萃取八角茴香油提取率高于正己烷和环己烷，所得八角茴香油为浅黄色澄清液体，具有浓郁的八角茴香气味，外观品质较好，适宜用于食品保鲜或医药、农业领域，且石油醚沸点低，蒸除时能耗较小。因此，选择石油醚（30～60 ℃）作为水蒸气蒸馏后萃取八角茴香油的最佳溶剂。

2.2 物料粉末浸泡时间对八角茴香油提取效果的影响

八角茴香粉末10 g（0.20～0.30 mm，筛孔径），按料液比1∶15 g·mL-1加入蒸馏水，分别浸泡0，6，12，24，36，48，60 h后，水蒸气蒸馏40 min，按1.3.1中的方法提取八角茴香油（萃取溶剂为石油醚，30～60 ℃，下同），考察物料粉末浸泡时间对八角茴香油提取效果的影响。

随着物料粉末浸泡时间的延长，八角茴香油提取率增加，但当浸泡时间超过36 h之后提取率基本保持不变，且浸泡时间过长，水溶液容易出现长菌现象。因此，选择在水蒸气蒸馏提取八角茴香油之前，先将物料粉末浸泡36 h以增加八角茴香油提取效果。

2.3    八角茴香油提取的单因素试验结果与分析

2.3.1   料液比 八角茴香粉末10 g（0.20～0.30 mm，筛孔径）分别按1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g·mL-1料液比加入蒸馏水，浸泡36 h后，水蒸气蒸馏40 min，按1.3.1中的方法提取八角茴香油，考察料液比对八角茴香油提取效果的影响。

随着水蒸气蒸馏时水的用量的加大，八角茴香油提取率先增加后降低，料液比为1∶20 g·mL-1时，提取率达到最高，为13.69%，此后再增加水量，提取率反而迅速下降。因此，选择1∶20 g·mL-1为水蒸气蒸馏法提取八角茴香油的最佳料液比，1∶15、1∶20、1∶25 g·mL-1作为正交试验水平。

2.3.2 蒸馏时间 八角茴香粉末10 g（0.20～0.30 mm，筛孔径）按1∶ 20 g·mL-1加入蒸馏水，浸泡36 h后，水蒸气蒸馏，时间分别为10，20，30，40，50，60 min，按1.3.1中的方法提取八角茴香油，考察蒸馏时间对八角茴香油提取效果的影响。

随着水蒸气蒸馏时间的延长，八角茴香油提取率先增大后减小，至40 min时达到最大值，此后，蒸馏时间再延长，提取率反而下降，这可能是由于蒸馏时间过长，在较高温度下，八角茴香油挥发损失导致。此外，蒸馏时间过长，烧瓶中水量蒸发加快，还存在蒸干的危险。因此，选择40 min为水蒸气蒸馏法提取八角茴香油的最佳蒸馏时间，30，40，50 min作为正交试验水平。

2.3.3 物料粉碎度 八角茴香粉末10 g（筛孔径<0.15，0.15～0.20，0.20～0.30，0.30～0.45，0.45～0.90，>0.90 mm）按料液比1∶20 g·mL-1加入蒸馏水，浸泡36 h后，水蒸气蒸馏40 min，按1.3.1中的方法提取八角茴香油，考察物料粉碎度对八角茴香油提取效果的影响。

八角茴香油的提取率随着物料粉碎程度的增加呈先增大后减小的趋势，0.20～0.30 mm（筛孔径）粉碎度的八角粉末提取八角茴香油效果最佳，此后，再增加物料粉碎程度，提取率下降。这可能是因为，物料粉碎程度增加，有利于八角茴香油的溶出，但是，物料粉碎程度过大时，容易造成物料之间的粘连，不利于八角茴香油的提取。因此，选择0.20～0.30 mm（筛孔径）为水蒸气蒸馏法提取八角茴香油的物料最佳粉碎度，0.15～0.20，0.20～0.30，0.30～0.45 mm作为正交试验水平。

2.4 水蒸气蒸馏法提取八角茴香油的正交试验

2.4.1 正交试验结果与分析 在单因素试验基础上，以八角茴香油提取率为评价指标，采用正交试验优化水蒸气蒸馏法提取八角茴香油的最佳工艺条件，因素及水平见表1，结果见表2。

由表2可知，水蒸气蒸馏法从八角茴香果实中提取八角茴香油的最佳工艺条件为：A2B3C3，即料液比1∶20 g·mL-1，蒸馏时间50 min，八角果实物料粉碎度0.30～0.45 mm（筛孔径）。极差分析表明，影响八角茴香油提取率的因素次序为：A>B>C，即料液比>蒸馏时间>八角果实粉碎度。

2.4.2 验证试验 对最佳提取工艺条件进行5次验证。结果表明，八角茴香油平均提取率为14.657%，相对平均偏差RSD为0.032%，说明此最佳提取工艺条件稳定、正确。笔者采用水蒸气蒸馏法提取八角茴香油的提取率高于李瑞红等[13]（10.87%，水蒸气蒸馏法）和王同禹等[9]（7.58%，水蒸气蒸馏法）报道的结果，这可能是因为试验采用了蒸馏前浸泡36 h，增加了八角油溶出效果，也与八角果实来源、蒸馏工艺条件和萃取所用溶剂存在差异有关。

2.5 八角茴香油的抑菌活性分析

采用滤纸片法测定八角茴香挥发性成分的油相组分（即八角茴香油）及水溶性组分对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌活性，试验结果见表3。

从表3可以看出，水蒸气蒸馏法提取的八角茴香油对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌均具有一定的抑菌效果，对枯草芽孢杆菌（革兰氏阳性菌）的抑制效果好于大肠杆菌（革兰氏阴性菌），这与WANG等[14]的研究结果一致;八角茴香挥发性成分的油相组分的抑菌效果优于水溶性组分，且抑菌活性随样品浓度的增加而增大。八角茴香挥发性成分的抑菌活性与其主要成分反式茴香腦密切相关[15]。此外，水蒸气蒸馏提取八角茴香挥发性成分的油相组分（八角茴香油）之后，通常会把烧瓶中剩余的澄清溶液（水溶性组分）弃掉。但从表3中的数据可知，浓度为1 000.0 mg·mL-1的水溶性组分对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌仍然具有一定的抑制效果，抑菌圈直径分别达到10.20±0.20 mm和10.95±0.29 mm，属于中等程度的敏感[16]。因此，在提取八角茴香挥发性成分的油相组分同时，还应该继续收集并利用水溶性组分，实现八角茴香挥发性成分的综合利用。

3 结论与讨论

据报道，水蒸气蒸馏法提取八角茴香油外观品质好，抑菌活性强，作为植物源抗菌剂用于食品保鲜和农业领域具有较好的应用前景。萃取溶剂、物料粉末浸泡时间、料液比、蒸馏时间和物料粉碎度均可对水蒸气蒸馏法提取八角果实中的八角茴香油产生一定程度的影响。

本试验结合单因素和L9（34）正交试验对料液比、蒸馏时间和物料粉碎度的提取工艺进行优化，其最佳组合为料液比1∶20 g·mL-1，水蒸气蒸馏时间50 min，八角果实粉碎度0.30～0.45 mm（筛孔径），以石油醚（30～60 ℃），作为萃取溶剂，提前将八角粉末浸泡36 h，在此条件下八角茴香油提取率可达14.657%，其中影响八角茴香油提取率的因素次序为料液比>蒸馏时间>八角果实粉碎度。

本试验对提取的八角茴香油抑菌活性进行了测定，其对枯草芽孢杆菌的抑制效果优于大肠杆菌，且抑菌效果随着浓度的增加而增大;八角茴香挥发性成分的油相部分（八角茴香油）的抑菌效果优于水溶性组分，但浓度为1 000.0 mg·mL-1的水溶性组分对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑制效果仍属于中度敏感，故在提取八角茴香挥发性成分的油相组分的同时，应该继续收集并利用水溶性组分，实现八角茴香挥发性成分的综合利用。

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