瑞舒伐他汀和阿司匹林对兔腹主动脉粥样硬化斑块疗效的磁共振研究

李明美 李安琪 黄娟 焦晟 邓晓涛 李浩 宋焱

高分辨磁共振成像已经成为动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）斑块定量分析的主要影像学方法。他汀类药和阿司匹林均具有延缓动脉粥样硬化的作用。他汀药物能够减少斑块内炎性细胞的聚集［1］，延缓、甚至逆转早期硬化斑块的发展［2,3］。阿司匹林通过抑制斑块内炎症反应从而抑制斑块的进展［4］。但两药联合应用是否能够强化这种作用，目前尚无动物实验的相应数据。本研究利用高胆固醇饮食联合球囊损伤腹主动脉内膜的方法建立兔腹主动脉AS模型，探讨瑞舒伐他汀、阿司匹林和两药联合三种方案对动脉AS斑块的治疗效果，并通过高分辨磁共振成像评估治疗后斑块的变化情况。

资料与方法

1.实验动物及分组

选择健康雄性新西兰兔160只［北京科宇动物养殖中心，2.2～2.5 kg，合 格证 号SCXK（京）2012-0004］，高胆固醇饲料（100 g/日）喂养1周，随后行腹主动脉内膜球囊剥脱术。术后，将160只新西兰兔随机分为对照组（高脂喂养）、A组（高脂喂养+阿司匹林治疗）、T组（高脂喂养+瑞舒伐他汀治疗）和AT组（高脂喂养+阿司匹林+瑞舒伐他汀治疗），每组40只。各组兔子随机分为术后1周组、2周组、1个月组和2个月组，每组10只。各组动物行腹主动脉管壁MR检查，MR检查后立即处死动物，尸检采集腹主动脉标本行HE染色和巨噬细胞免疫组化染色。

2.给药剂量

A组阿司匹林50 mg每日一次，T组瑞舒伐他汀5 mg每日一次，AT组阿司匹林50 mg每日一次及瑞舒伐他汀5 mg每日一次。由中国医学科学院药物研究所动物室进行统一饲养、喂药，给药时需防止药物被吐出。

3.兔腹主动脉粥样硬化模型建立

160只新西兰兔高脂喂养1周后，行经股动脉穿刺腹主动脉内膜球囊剥脱术。步骤如下：经兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠麻醉，剪去右大腿内侧兔毛并脱毛处理，消毒、铺巾后，2%利多卡因皮下注射行局部麻醉，沿右股动脉走行切开皮肤，于肌肉间隙钝性分离股动脉，远心端结扎，用10号穿刺针行股动脉穿刺，经穿刺针将导引导丝送至腹主动脉，置入4F血管鞘，通过血管鞘支臂推注肝素生理盐水防止凝血，经血管鞘把直径4 mm、长15 mm的球囊扩张导管送入腹主动脉，连接压力泵，将球囊加压并维持球囊内压力在8 atm，外拉球囊导管约20 cm（约至髂总动脉水平），将压力泵归零。球囊再次送入原位置，如此反复3次，完成球囊对腹主动脉内膜的损伤。结扎右股动脉近心端，术区涂撒青霉素钠粉剂，逐层缝合。术后3 d内肌肉注射青霉素钠注射液预防感染。

4.兔腹主动脉MR扫描

MR检查在Philips Achieva 3.0T MR扫描仪上进行，采用膝关节线圈。耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠（2.4～2.7 mg／kg）麻醉，将兔置人膝关节线圈内，左侧卧位，足先进。扫描序列包括3D TOF、T1WI、T2WI和增强T1WI。首先进行二维时间飞跃（2D TOF）序列扫描作为定位像，以髂动脉分叉作为扫描起始层面，扫描范围为髂血管分叉上方共6 cm的腹主动脉。增强扫描由高压注射器从兔耳缘静脉注射钆喷酸葡胺（北陆药业），剂量为0.15 mmol/kg（1 ml/kg），注射流率为0.7 ml/s，延迟时间为5 min。

5.MR图像分析

将MR图像传输至VTS工作站（清华大学生物医学影像中心提供），利用后处理软件CASCADE（美国华盛顿大学血管成像中心），由具有多年CASCADE软件应用经验的医师盲法对所有的影像资料进行定量分析，手动描绘出MR图像中兔腹主动脉管腔及管壁外缘轮廓（图1），通过后处理软件计算得到扫描范围内每一层面血管壁管壁面积值、管腔面积值。管壁标准化指数（normalized wall index,NWI）=管壁面积/（管壁面积+管腔面积）。

6.组织学检查

MR扫描后立即经耳缘静脉注射过量3%戊巴比妥钠处死实验兔，以髂动脉分叉为参照点分离腹主动脉，生理盐水冲洗干净后，置于10%的甲醛溶液固定24 h。随后进行系列脱水、浸蜡和包埋处理。对血管进行横断面切片，切片厚度为5μm，行HE染色和巨噬细胞RAM-11免疫组化染色。

使用Image-Pro Plus专业图像分析软件对免疫组化染色图像进行分析。积分光密度（integrating optical density，IOD）为测量标本结构范围内各个像素点光密度之和，可反映被测结构的光密度与面积的综合变化，IOD与被染物质的质量成正比［5］，因此本研究中以IOD值的大小反映AS斑块内巨噬细胞的相对含量。

7.统计学方法

以SPSS 13.0软件包建立数据库进行统计分析，连续变量用Kolmogorov-Smirnov Z检验进行正态性检验。组间比较采用两独立样本t检验，P＜0.05示差异有显著性。

图1 兔腹主动脉同一位置MR图像（左侧卧位，层数：12）a)T1WI;b)增强T1WI;c)T2WI，细箭：腹主动脉，粗箭：下腔静脉

结 果

160只实验兔中41只因麻醉意外或手术死亡，3只因厌食、腹泻死亡，另有10只未能完成MR检查。最终完成MR的有106只，完成组织学染色的有116只（表1）。

表1 实验兔最终分组和完成情况

1.腹主动脉管壁标准化指数（NWI）的变化

1周时，对照组、A组、T组和AT组MR图像所测得管壁标准化指数分别为0.450±0.025、0.386±0.024、0.384±0.023、0.374±0.026。A组、T组和AT组NWI均比对照组减少，分别减少了14.2%、14.7%、16.9%（P＜0.05）。2周时，对照组、A组、T组和AT组MR图像所测得管壁标准化指数分 别 为0.410±0.046、0.396±0.032、0.388±0.033、0.386±0.062，分别比对照组减少了3.4%、5.4%、5.9%（P＞0.05）。1个月时，对照组、A组、T组和AT组MR图像所测得管壁标准化指数分别为0.453±0.027、0.370±0.019、0.392±0.043、0.391±0.031，分别比对照组减少了18.3%、13.5%、13.7%（P＜0.05）。2个月时，对照组、A组、T组和AT组MR图像所测得管壁标准化指数分别为0.447±0.032、0.369±0.022、0.386±0.023、0.387±0.025，分别比对照组减少了17.4%、13.6%、13.4%（P＜0.05）。

2.腹主动脉组织学的变化

（1）HE染色标本观察：正常腹主动脉内膜较薄，在腔面只见一层内皮细胞核及一层红色、呈波浪状的内弹性膜，内皮下无脂质沉积，无泡沫细胞或斑块形成。

对照组1周时腹主动脉内膜呈环形或偏心性轻度增厚，内膜可见少量、散在分布的泡沫细胞；2周时动脉内膜进一步增厚，呈不均匀环形或偏心性增厚，内膜可见单个或多个聚集存在的泡沫细胞、细胞外脂滴形成；1个月时动脉内膜呈环形或偏心性显著增厚，残余管腔面积明显变小，呈现以内膜下层大量泡沫细胞聚集、脂滴沉着、胶原纤维增生排列紊乱为标志的动脉粥样硬化表现，少数血管内膜表面为纤维细胞层；2个月时动脉内膜增厚较1个月时轻度增加，内膜下泡沫细胞聚集及脂滴沉积较1个月时明显增多，内膜表面纤维细胞层较1个月时明显，部分血管内膜表面可见大量泡沫细胞聚集。

A组、T组和AT组1周时动脉内膜增厚较对照组1周时减轻，部分内膜未见增厚改变。A组、T组和AT组2周时可见内膜增厚，内膜下泡沫细胞和细胞外脂滴沉积，上述变化较对照组2周时减轻。A组、T组和AT组1个月时内膜增厚、内膜下泡沫细胞聚集、脂滴沉积及胶原纤维增生较其2周时进展，较对照组1个月时减轻。2个月时A组、T组和AT组内膜增厚程度与1个月时接近，内膜下泡沫细胞数量及脂滴沉积较1个月时增多，上述变化较对照组2个月时减轻（图2）。

（2）巨噬细胞免疫组化（RAM-11）染色结果：阳性染色表现为位于内膜的棕黄色颗粒，以内膜中下部分布为主，中膜及外膜亦可见少量阳性表达（图3）。

2个月时，对照组、A组、T组、AT组巨噬细胞积分光密度（IOD）分别为（8.6±3.4）×104、（3.7±1.8）×104、（5.8±2.2）×104、（7.1±3.1）×104，A组、T组、AT组的巨噬细胞数量均比对照组减少，分别减少了57.4%、31.5%、17.4%。

图3 对照组2个月巨噬细胞免疫组化（RAM-11）染色

讨 论

高分辨磁共振血管壁成像可清楚显示斑块形态，并定性、定量分析斑块成分［5,6］，对斑块稳定性做出评价。研究表明，MRI在体测量AS斑块的形态学参数与组织病理学测量值高度相关［7,8］，表明高分辨MRI可准确反映AS斑块负荷。管壁标准化指数对斑块纵轴覆盖长度和血管粗细不敏感［9］，且不受早期动脉壁重塑机制的影响［10］，因此管壁标准化指数是评估斑块负荷的重要指标，可直接反映AS病变的消长。

1.瑞舒伐他汀对斑块的治疗作用及MR评价

他汀类药是临床常用的降脂药物。Makiko Yogo等［11］使用MRI检测瑞舒伐他汀治疗1年后AS的变化情况，发现降脂治疗后动脉管壁面积和管壁最大厚度均减少，提示瑞舒伐他汀长期治疗能抑制AS斑块负荷，逆转AS斑块的进展。本研究利用瑞舒伐他汀治疗兔腹主动脉AS斑块1周、2周、1个月及2个 月 时，进 行MRI扫 描及组 织HE染色，发现在各个时间点，管壁标准化指数均比对照组减少，HE染色内膜增厚程度较对照组减轻，提示瑞舒伐他汀短期治疗也能够抑制斑块进展，高分辨MRI技术可以评估和监测药物的治疗效果。研究提示他汀类药物延缓AS之效能独立于基线LDL-C水平之外［12,13］。动物实验表明，阿托伐他汀可降低兔动脉硬化模型内膜及中膜单核细胞趋化蛋白水平，减弱巨噬细胞及平滑肌细胞、核因子-kB活性，从而抑制炎症反应［14］。本研究中瑞舒伐他汀组在2个月时，斑块内巨噬细胞浸润较对照组明显减少，与既往研究结果一致，提示瑞舒伐他汀具有抗炎作用，通过抑制斑块内炎症反应减缓AS病变进展。

2.阿司匹林对斑块的治疗作用及MR评价

阿司匹林是一种非甾体类抗炎药。Paul等［15］研究发现使用阿司匹林治疗高胆固醇饮食的载脂蛋白E基因缺陷小鼠10周后，主动脉斑块面积减少35%。唐熠达等［16］研究结果显示应用阿司匹林治疗兔主动脉AS斑块12周后，斑块面积及内膜增生均减小，提示阿司匹林长期应用能抑制AS斑块进展。本研究中阿司匹林组，在1周、2周、1个月及2个月时，动脉管壁负荷均较对照组减少，HE染色动脉内膜增厚程度较对照组减轻，提示阿司匹林短期应用亦能减缓AS斑块发生和发展进程，高分辨MRI能够对斑块负荷的变化进行评估和监测。Cyrus等［17］、唐熠达等［16］发现阿司匹林能剂量依赖地显著降低血清C-反应蛋白和单核细胞趋化蛋白-1水平，二者是重要的炎症标志物，还直接参与AS斑块的形成和进展过程［18,19］。同时斑块内巨噬细胞、平滑肌细胞浸润也显著减少，提示阿司匹林抑制AS斑块的作用与其抗炎作用有关，且阿司匹林的抗炎作用呈剂量依赖性。本实验中，阿司匹林50 mg/d（约等于临床剂量440 mg/d［20］）2个月时斑块内巨噬细胞数量比对照组显著减少，提示阿司匹林可通过直接抑制炎症细胞浸润来抑制AS斑块进展，有利于粥样斑块的稳定性，与既往的研究结果一致。

3.阿司匹林联合瑞舒伐他汀对斑块的治疗作用及MR评价

在1周、2周、1个月及2个月时，AT组管壁标准化指数比对照组显著性减小，HE染色动脉内膜增厚程度较对照组减轻，内膜下泡沫细胞及细胞外脂滴均较对照组减少，提示两药联合使用能减缓AS斑块进展，抑制斑块内炎症反应从而稳定斑块。

A组、T组、AT组对斑块负荷的抑制效果比较如下：在1周、2周时，治疗效果由强到弱依次是AT组、T组、A组；在1个月、2个月时，治疗效果由强到弱依次是A组、T组、AT组。2个月时，对斑块内巨噬细胞浸润的抑制效果比较如下：由强到弱依次是A组、T组、AT组。这一结果提示在斑块发生和发展的不同时期，三种治疗方案对斑块负荷、斑块内炎症反应的治疗效果是不同的。此研究结果对临床的指导意义有待于进一步验证。

小 结

本研究通过高脂饮食联合动脉内膜损伤的方法建立兔腹主动脉粥样硬化模型，使用阿司匹林、瑞舒伐他汀和两药联合三种方案治疗AS斑块，通过高分辨MRI观察斑块负荷及斑块形态学、斑块内巨噬细胞数量的变化，发现三种方案斑块负荷均较对照组减小，斑块内膜增厚程度较对照组减轻，斑块内巨噬细胞数量较对照组减少，证明在AS斑块形成和发展过程中，阿司匹林、瑞舒伐他汀以及两药联合均能抑制斑块内炎症反应，减缓AS疾病的进展，黑血MR技术可用于对药物疗效的评估。