荆芥挥发油抗内毒素中毒小鼠NLRP3炎症小体通路的机制研究

吕红君，温桃群，罗 杰，刘小波，杨 菊，曾 南

(1. 成都中医药大学药学院，中药材标准化教育部重点实验室，中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137；2. 四川大学生物治疗国家重点实验室，四川 成都 610064)

荆芥为唇形科一年生草本植物荆芥(SchizonepetatenuifoliaBriq.)的干燥地上部分，是临床常用解表药，其味辛性平而偏寒，具有良好的祛风解表功效，临床上常用于治疗与风邪有关的表证及皮肤、头目疾患，而这些疾病都与炎症的病理过程相关。荆芥挥发油(essential oils ofSchizonepetatenuifoliaBriq., EOST)含量丰富，是其辛味药性的物质基础之一[1]。实验室前期研究表明，EOST预防给药能通过下调促炎因子的释放，减轻炎性细胞浸润等，抑制炎症反应，从而发挥对内毒素中毒模型小鼠的保护作用，但其抗炎效应的分子机制有待进一步研究[2]。本研究基于前期药效研究基础，从NLRP3炎症小体激活角度，探讨EOST对内毒素中毒模型小鼠保护作用的抗炎效应机制，以期进一步揭示其抗炎作用机制，为EOST治疗“表证”的临床应用提供科学依据。

1 材料

1.1实验动物♂C57BL/6J小鼠(动物合格证号11400700130007)，体质量(20±2)g，SPF级，购自北京维通利华实验动物有限公司，许可证号：SCXK(京)2012-0001。

1.2药物与试剂荆芥，购自成都新荷花池中药材市场，经成都中医药大学中药鉴定教研室严铸云教授鉴定，为唇形科一年生草本植物荆芥(SchizonepetatenuifoliaBriq.)的地上部分。EOST的制备同文献[2]，实验时用0.35%吐温-80(Tween-80)配制药物，给药剂量分别为其半数致死量(LD50)的1/10和1/5，即0.226、0.452 g·kg-1。地塞米松、脂多糖(lipopolysaccharides from Escherichia coil 055:B5, LPS)，均购自美国Sigma公司; NO试剂盒，购自碧云天生物技术研究所;FastQuant cDNA 第一链合成试剂盒、SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)，均购自天根生化科技(北京)有限公司；AxyPrepTMMultisource Total RNA Miniprep Kit, 购自Axygen公司；抗组织蛋白酶(Cathepsin)B、嘌呤受体 P2X7(purinergic 2X7 receptor, P2X7R)、GADPH、COP1抗体，均购自美国Abcam公司；抗NLRP3、pro-IL-1β抗体，均购自美国Cell Signaling公司；生物素化山羊抗兔IgG(H+L)、辣根酶标记链霉素卵蛋白素(HRP/A-V)、浓缩型DAB试剂盒，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；凋亡相关的斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC) 抗体，购自Abbexa; caspase-1(p20)抗体，购自Santa Cruz公司；引物均由Invitrogen公司设计。

1.3仪器酶标仪、NanoDrop 2000(美国Thermo Fisher Scientific公司)；PCR仪、凝胶成像系统、转膜仪(美国Bio-Rad公司)；2015型轮转式切片机(德国徕卡公司)；TSJ-Ⅱ型组织脱水机(常州市中威电子仪器有限公司)；BA200Digital 数码三目摄像显微摄像系统(麦克奥迪实业集团有限公司)。

2 方法

2.1实验分组、给药与造模取健康C57BL/6J♂小鼠，按体质量分层，随机分为空白组、模型组、地塞米松(0.005 g·kg-1)组、EOST(0.226、0.452 g·kg-1)组。除地塞米松组在d 4、5腹腔注射给药2次外，其余给药组小鼠按20 mL·kg-1体积灌胃给药，空白组与模型组给予等体积0.35%吐温-80溶液，连续给药5 d。末次给药后30 min，小鼠腹腔注射LPS (0.015 g·kg-1，10 mL·kg-1) 造模，造模后12 h剖取小鼠肺组织，将右肺置于-80℃保存，左肺置于体积分数为10%的中性福尔马林溶液中，用于免疫组化实验。

2.2小鼠肺组织中NO含量的检测按试剂盒说明书制备肺组织匀浆，采用Griess法进行NO含量测定。

2.3小鼠肺组织NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、iNOS、p65mRNA的检测取 “2.1”项下所得右肺组织于冰上解冻后，按照Axygen总RNA小量制备试剂盒步骤提取总RNA，测定总RNA纯度和浓度，并检测所得总RNA样本的完整性(琼脂糖凝胶)。逆转录合成cDNA，qPCR分析NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、iNOS、p65 mRNA的表达。采用相对定量法，以GADPH基因为内参基因，以样本的平均Ct值作为校正值，通过差异值反映EOST对模型小鼠肺组织NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、iNOS、p65 mRNA表达的影响。引物序列见Tab 1。

2.4免疫组化检测小鼠肺组织CathepsinB、P2X7R的表达将 “2.1”项下所得左肺组织石蜡切片常规脱蜡至水，热抗原修复和山羊血清封闭后，用一抗、二抗孵化，DAB显色，苏木精复染，脱水，透明，中性树胶封片。采集图像，细胞膜或细胞质内出现浅黄色或棕色的颗粒物质为阳性表达。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统，测定所采集全部图像的平均光密度(平均光密度=黄色或棕色部分的累积光密度值/照片面积)。

2.5Westernblot检测小鼠肺组织NLRP3、caspase-1(p20)、pro-IL-1β、COP1蛋白表达取各组小鼠右肺组织40 mg，加入液氮制成粉末状，再加入400 μL RIPA裂解液制备匀浆，4℃、10000 r·min-1离心5 min，取上清，釆用BCA法测定蛋白含量，将所有蛋白样本调至等浓度。取低温保存的蛋白样品，95 ℃水浴加热5 min后，上样电泳。采用湿法转膜，转膜后的PVDF膜用封闭液(5%脱脂牛奶)封闭2 h，加入一抗孵育过夜，漂洗后，加入二抗孵育1.5 h。显色液显色后测定灰度值，运用 Image lab图像分析系统测定光密度值，目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值即为蛋白相对含量，进行统计分析。

Tab 1 Gene primer sequences

3 结果

3.1EOST对LPS中毒模型小鼠肺组织NO含量的影响如Tab 2所示，模型组小鼠NO含量较空白对照组明显升高(P<0.05)；EOST 0.452 g·kg-1剂量组小鼠肺组织NO含量较模型组明显降低(P<0.05)。

Tab 2 Effect of EOST on level of NO in lung tissues of inflammatory mice induced by endotoxin n=7～8)

#P<0.05vscontrol;*P<0.05vsmodel

3.2EOST对模型小鼠肺组织NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、iNOS、p65mRNA表达的影响Tab 3所示，与空白组比较，模型组小鼠肺组织中NLRP3、caspase-1、iNOS、p65、IL-1β mRNA表达水平明显升高(P<0.01，P<0.05)，提示NLRP3炎症小体被激活。与模型组比较，EOST 0.452 g·kg-1明显降低小鼠肺组织中NLRP3、iNOS、p65、IL-1β mRNA的表达(P<0.01，P<0.05)。

3.3EOST对内毒素中毒模型小鼠肺组织CathepsinB、P2X7R表达的影响由Fig 1可知，与空白组相比，模型组小鼠肺组织Cathepsin B、P2X7R蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。与模型组比较，EOST 0.226 g·kg-1明显降低模型小鼠肺组织Cathepsin B蛋白含量(P<0.01)，EOST 0.452 g·kg-1明显降低小鼠肺组织中P2X7R蛋白含量(P<0.05)。

3.4EOST对中毒模型小鼠肺组织NLRP3、caspase-1(p20)、pro-IL-1β、COP1蛋白表达的影响如Fig 2所示，与空白组比较，模型组小鼠肺组织中NLRP3、p20、pro-IL-1β蛋白表达量明显上升(P<0.01，P<0.05)，COP1蛋白表达明显降低(P<0.05)。与模型组比较，EOST(0.226、0.452 g·kg-1)能明显下调p20蛋白水平(P<0.01，P<0.05)，二者亦能明显升高COP1蛋白水平(P<0.01，P<0.05)；EOST 0.226 g·kg-1明显下调NLRP3蛋白表达水平(P<0.05)。

4 讨论

病原微生物的感染是“表证”的一个主要病因，炎症反应是“表证”的一个主要病理环节，解表药的解表功效与其抗炎作用密切相关。由于肺为“娇脏”，易受外邪入侵，且“肺主皮毛”，然“皮毛”为一身之表，有抵御外邪之功能，是人体抵抗外邪的屏障。LPS是革兰阴性菌细胞壁的重要成分，作为细菌分泌的内毒素，是导致炎症反应发生的重要原因。本研究选择LPS腹腔注射诱导的内毒素中毒模型小鼠，基于前期药效学的研究基础[2]，以NLRP3炎症小体通路为切入点，探讨EOST对内毒素中毒模型小鼠保护作用的抗炎效应分子机制，为荆芥“解表祛邪”功效的科学内涵阐释提供更为丰富的科学依据。

Tab 3 Effect of EOST on expressions of NLRP3, ASC, caspase-1, IL-1β, iNOS, p65 mRNA in lung tissues of inflammatory mice induced by endotoxin n=4～5)

#P<0.05,##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

Fig1EffectofEOSTonproteinexpressionsofCathepsinBandP2X7Rinlungtissuesofinflammatorymiceinducedbyendotoxin

Fig 2 Effect of EOST on expressions of NLRP3, caspase-1(p20), pro-IL-1β, COP1 protein in lung tissues of inflammatory mice induced by endotoxin n=4)

#P<0.05,##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

机体在受到革兰阴性细菌感染时，LPS作用于细胞膜受体，可导致大量炎性细胞因子和炎性介质的产生。NO是内毒素中毒机体产生的一种重要活性物质，其参与炎症反应，作用复杂，在不同类型的炎症反应和炎症阶段发挥着抗炎或者促炎的作用。体内NO由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)催化L-精氨酸产生，NOS包括结构型一氧化氮合酶(constitutive NOS, cNOS)和诱导型一氧化氮合酶(inducible NOS, iNOS)，cNOS 可源源不断地产生，而iNOS只有在受到感染或其他刺激时才产生[3]。炎症反应中，经LPS和细胞因子刺激后，会生成iNOS，从而合成大量NO[4]。在高浓度条件下，NO激活NF-κB，诱导促炎症细胞因子TNF-α、IL-1β等的产生，TNF-α的产生又可激活iNOS，促进机体产生更多的NO，从而形成正反馈循环，使炎症细胞因子的分泌及NO自身的表达得以持续，致使炎症反应更持久、剧烈[5]。文献表明，薄荷酮抗炎作用的发挥可能通过影响 NO 的释放，来干扰NLRP3炎症小体的激活[6]。本研究发现，由LPS引起的中毒模型小鼠肺组织中NO的水平和 iNOS基因的转录水平均明显升高，表明小鼠处于炎症病理状态。EOST能减少模型小鼠肺组织中NO水平，下调 iNOS mRNA表达水平，进一步验证表明该挥发油对内毒素中毒模型小鼠有抗炎保护作用。

NLRP3炎症小体由核心蛋白NLRP3、接头蛋白ASC和效应蛋白caspase-1组成，能被一些内源性危险信号和外源性因素所激活，包括活性氧(reactive oxygen species, ROS)、LPS等[7-8]。NLRP3炎症小体受到这些激活剂刺激后，效应蛋白caspase-1会负责将无活性的前炎症因子Pro-IL-18和Pro-IL-1β剪切为成熟的IL-18和IL-1β，从而激活下游相关信号通路，生成大量的炎症介质，诱导机体发生严重的炎症反应。本研究发现，小鼠经内毒素攻击后，其肺组织中NLRP3、caspase-1、IL-1β mRNA表达明显升高，肺组织NLRP3、caspase-1(p20)和 Pro-IL-1β 蛋白表达亦明显增加，表明该模型小鼠肺组织中NLRP3炎症小体信号通路被激活，而EOST预防性给药，可明显下调模型小鼠肺组织中NLRP3、IL-1β mRNA和NLRP3、caspase-1(p20)蛋白表达水平，提示EOST对NLRP3炎症小体信号通路的激活具有抑制作用。

NLRP3炎症小体上游通路较为复杂，其激活的机制也不尽相同。其中， P2X7R是ATP门控离子通道，参与了机体免疫反应。K+外流是NLRP3炎症小体活化的关键环节，细胞内的K+可通过P2X7R外流，进而激活NLRP3炎症小体信号通路[9]。受到ATP刺激后，溶酶体被破坏，释放的Cathepsin B等多种溶酶体水解酶可介导NLRP3炎症小体的激活[10]。p65作为NF-κB信号通路激活的标志性蛋白，p65 mRNA的表达增加则表明NF-κB信号通路处于激活状态，调控NF-κB的活性能间接影响NLRP3炎症小体的激活[11]。只含CARD结构域蛋白COP1在炎症小体调控中发挥重要作用，COP1含有1个与caspase-1相似的CARD结构域，所以COP1可以通过竞争caspase-1，干扰炎症小体的组装，从而负向调控NLRP3炎症小体活化[12]。本实验结果显示，模型组小鼠肺组织 P2X7R、Cathepsin B蛋白表达明显升高，p65、caspase-1 mRNA表达明显增高，COP1蛋白表达明显降低，表明该模型小鼠肺组织NLRP3炎症小体激活，其激活机制涉及多条上游信号通路。EOST预防性给药，能明显下调模型小鼠肺组织中P2X7、Cathepsin B蛋白，以及p65、caspase-1 mRNA的表达，明显上调COP-1蛋白表达，提示EOST抑制NLRP3炎症小体的激活是其抗炎作用机制之一，可能通过影响K+/P2X7R、溶酶体/Cathepsin B、NF-κB、COP-1/caspase-1等多种途径，发挥抑制效应。

综上，LPS所诱导的中毒模型小鼠体内NLRP3炎症小体信号通路呈现激活状态，EOST对内毒素中毒模型小鼠有抗炎保护效应，且EOST抑制NLRP3炎症小体的激活是通过干扰K+/P2X7R、溶酶体/Cathepsin B、NF-κB、COP-1/caspase-1等多途径发挥作用的，但对于炎症小体激活后其聚合体之间关系的变化尚不明晰，有待进一步深入。