蔬菜复合可溶性膳食纤维酶法提取及抗氧化活性研究

张博华 ，张明 ，杨立风 ，门庆永 ，陈彩霞 ，王崇队 ，马超 *

（1.中华全国供销合作总社济南果品研究院，山东济南250014；2.山东恒宝食品集团有限公司，山东日照276500）

膳食纤维是指不易被人体消化吸收的食物营养素，被称为第七大营养素，包括纤维素、半纤维素、木质素和果胶等。膳食纤维具有多种功效，能增加饱腹感；调节血糖平衡，预防糖尿病；调整肠道菌群，预防便秘和改善心脑血管疾病[1]。根据其能否在热水或温水中溶解，又分为可溶性膳食纤维（Soluble dietary fiber，SDF）和不可溶性膳食纤维（Insoluble dietary fiber,DF）。对人体起主要功效的是可溶性膳食纤维，包括葡聚糖、果胶、树胶、藻胶、豆胶、琼脂和羟甲基纤维素等[2]。可溶性膳食纤维既能溶解于水，又能吸水膨胀，并能被大肠中微生物降解。可溶性膳食纤维可增加饱腹感、降低脂肪的热比值，避免体内脂肪的过度积累，达到控制体重的目的[3]。

目前针对可溶性膳食纤维的提取研究主要集中在单一物料上，复合物料可溶性膳食纤维的提取研究还较少。研究发现，多种膳食纤维复合作用效果比单一膳食纤维更佳，且复合膳食纤维的组合作用并不是简单地相加作用，而是存在复杂的协同关系。此外，复合可溶性膳食纤维提取对工厂化生产具有积极影响，可减少重复的提取环节，提高生产效率和产品品质。本研究在前期调研的基础上，选取西蓝花、苦瓜、魔芋、金针菇四种蔬菜作用原料[4]，采用淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等生物酶制剂进行蔬菜复合可溶性膳食纤维的提取研究，通过正交优化试验确定最佳提取工艺，并对其抗氧化活性进行分析，以期为蔬菜复合可溶性膳食纤维的提取及综合利用提供指导。

1 材料和方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

西蓝花、苦瓜、金针菇、魔芋，均购于山东恒宝食品集团有限公司。

α-高温淀粉酶（40000 U/g）、蛋白酶（50000 U/g）、糖化酶（100000 U/g）、DPPH，美国 Sigma公司。无水乙醇、盐酸、硝酸银、氯化钠、氢氧化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、铁氰化钾、氯化亚铁、硫酸铁、水杨酸、双氧水等均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司生产。

1.1.2 仪器与设备

ME104电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；pHS-3C型pH计，上海仪电科学仪器有限公司；SHA-B双功能水浴恒温振荡器，江苏杰瑞尔电器有限公司；pHP-250A型高速多功能粉碎机，浙江永康市荣浩工贸有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；DGG-9070B型电热恒温鼓风干燥箱，上海森信实验仪器有限公司；UV1000紫外分光光度计，上海天美科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 蔬菜复合可溶性膳食纤维提取工艺流程

原料复配→蒸馏水混匀→高温淀粉酶90℃酶解→冷却→蛋白酶45℃酶解→调整pH→60℃糖化酶酶解→加热灭酶→离心→取上清液→醇沉→抽滤→干燥→蔬菜复合可溶性膳食纤维。

1.2.2 工艺操作要点

称取苦瓜、魔芋、西蓝花、金针菇四种原粉各1 g，进行复配，加入一定量的蒸馏水混匀并水浴加热到90℃备用。在原料液体中加入淀粉酶溶液，90℃酶解一段时间。酶解结束后冷却至45℃，并加入蛋白酶进行酶解。待酶解完成立刻调整pH到4.0～4.5，达到糖化酶的最适pH，同时使蛋白酶灭活。加入糖化酶25 U/g，60℃酶解60 min，之后加热灭酶。样品液离心取上清液，用无水乙醇提取可溶性膳食纤维，抽滤烘干得到蔬菜复合可溶性膳食纤维。

1.2.3 单因素试验

在高温淀粉酶最适温度（90℃）与pH（5.5）条件下，分别考察高温淀粉酶的加入量（50、100、150、200、250 U/g）、酶解时间（20、40、60、80、100 min）；在最适温度（60℃）最适pH（5.5）条件下，分别考察蛋白酶的加入量（375、750、1125、1500、1875 U/g）、酶解时间（20、40、60、80、100 min）；料液比（1:20、1:40、1:60、1:80、1:100）对四种蔬菜复合可溶性膳食纤维提取率的影响。

1.2.4 正交试验设计

根据单因素试验结果，分别选取高温淀粉酶的添加量、淀粉酶酶解时间、蛋白酶添加量、蛋白酶酶解时间四个因素，以复合可溶性膳食纤维的提取率为测定指标，进行正交试验[5]。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 可溶性膳食纤维提取得率计算

式中：c为测得复合可溶性膳食纤维浓度，mg/mL；

n为稀释倍数；

v为复合可溶性膳食纤维溶液体积，mL；

m为复合原料质量，mg。

1.3.2 抗氧化活性的测定

将蔬菜复合可溶性膳食纤维、西蓝花可溶性膳食纤维、金针菇可溶性膳食纤维、魔芋可溶性膳食纤维、苦瓜膳食纤分别配置成 0.5、1、1.5、2、2.5、3 mg/mL 的样品溶液，进行DPPH自由基清除活性、羟自由基清除活性和还原能力的测定。

（1）DPPH自由基清除活性测定

取2 mL的样品溶液和2 mL、0.2 mmol/L DPPH溶液放入试管中，充分混合后避光静置30 min，在517 nm处测定其吸光度A1。同法测定2 mL样品溶液和2 mL无水乙醇混匀后的吸光度A2和2 mL DPPH溶液加入2 mL蒸馏水的吸光度A0，同时用VC标准品作为对照。

（2）·OH自由基清除活性测定

取不同浓度的可溶性膳食纤维样品溶1 mL分别加入到试管中，分别依次加入1 mL、8 mmol/L FeSO4溶液，1 mL、8 mmol/L 水杨酸-乙醇溶液，1 mL、8 mmol/L H2O2。充分混匀后静置1 h，在510 nm处测定吸光值A4。同样方法，用蒸馏水替代样品测得吸光度A；用蒸馏水替代H2O2测得吸光度A3，同时用VC标准品作为对照[6]。

（3）还原力测定

取不同浓度的可溶性膳食纤维样品溶液0.5 mL，加入2.5 mL、0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.6、0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液62.5 mL+0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液37.5 mL）和2.5 mL、1%铁氰化钾溶液，混匀后于50℃温度水浴保温20 min，然后加入2.5 mL、10%的三氯乙酸溶液、5 mL蒸馏水和1 mL、0.1%氯化铁溶液，混合均匀，静置10 min，以无水乙醇代可溶性膳食纤维提取液按上述处理作空白对照，于700 nm波长处测定吸光度[7]。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 淀粉酶添加量对蔬菜复合可溶性膳食纤维提取得率的影响

图1 淀粉酶添加量对蔬菜复合可溶性膳食纤维提取得率影响Fig.1 Effect of amylase addition amount on extraction rate of SDF from compound vegetables

图1（见上页）显示了高温淀粉酶添加量对蔬菜复合可溶性膳食纤维提取得率的影响。由图可知，当高温淀粉酶的添加量在0～200 U/g之间时，复合可溶性膳食纤维提取率呈现上升趋势，说明在此加酶量范围内，加酶量越多，溶出的可溶性膳食纤维越多。但是当加酶量高于200 U/g时，复合可溶性膳食纤维提取率曲线变化较小，略有下降。因此，高温淀粉酶最适的添加量为200 U/g。

2.1.2 蛋白酶添加量对蔬菜复合可溶性膳食纤维提取得率的影响

图2显示了蛋白酶添加量对蔬菜复合可溶性膳食纤维提取得率的影响。由图可知，当蛋白酶的添加量在0～1125 U/g之间时，复合可溶性膳食纤维提取率呈现上升趋势。说明在此加酶量范围内，加酶量越多，溶出的可溶性膳食纤维越多。但是当加酶量高于1125 U/g时，复合可溶性膳食纤维提取率曲线略有下降。因此，蛋白酶最适添加量为1125 U/g。

图2 蛋白酶添加量对蔬菜复合可溶性膳食纤维提取得率影响Fig.2 Effect of protease addition amount on extraction rate of SDF from compound vegetables

2.1.3 淀粉酶反应时间对蔬菜复合可溶性膳食纤维提取得率的影响

图3显示了高温淀粉酶反应时间对蔬菜复合可溶性膳食纤维提取率的影响。由图可以得出，当酶处理时间小于60 min时，复合可溶性膳食纤维提取率随着处理时间的增加而明显上升；当酶处理时间超过60 min时，复合可溶性膳食纤维提取率变化平稳。故淀粉酶酶解的最佳处理时间为60 min。

图 3 高温淀粉酶反应时间对蔬菜复合可溶性膳食纤维提取率影响Fig.3 Effect of amylase reaction time on extraction rate of SDF from compound vegetables

2.1.4 蛋白酶反应时间对蔬菜复合可溶性膳食纤维提取率的影响

图4显示了蛋白酶反应时间对蔬菜复合可溶性膳食纤维提取率的影响。由图可以得出，当蛋白酶的处理时间小于60 min时，复合可溶性膳食纤维提取率随着处理时间的增加而明显上升；当蛋白酶的处理时间超过60 min时，复合可溶性膳食纤维提取率呈现平稳趋势。故蛋白酶酶解的最佳处理时间为60 min。

图4 蛋白酶反应时间对蔬菜复合可溶性膳食纤维提取率影响Fig.4 Effect of protease reaction time on extraction rate of SDF from compound fruit and vegetable

2.1.5 料液比对蔬菜复合可溶性膳食纤维提取率的影响

根据图5可知，料液比对蔬菜复合可溶性膳食纤维提取率随料液比的增加呈现先上升后下降的趋势。当料液比在1:40时达到最高，当料液比过高时蔬菜复合可溶性膳食纤维提取率开始下降，这可能是因为在料液比1:40时样品中可溶性膳食纤维已经完全溶出。当料液比过大时不利于后期的提取，导致提取率缓慢下降。因此料液比选择1:40左右为宜。

图5 料液比对蔬菜复合可溶性膳食纤维提取率的影响Fig.5 Effect of material-to-liquid ratio on extraction rate of SDF from compound vegetables

2.2 正交试验结果与分析

在单因素试验的基础上，发现淀粉酶添加量、蛋白酶添加量、淀粉酶反应时间、蛋白酶反应时间四个因素对蔬菜复合可溶性膳食纤维的提取率影响较大，因此进行L9(34)正交试验，各因素水平设计见表1，结果见表2。

表1 正交试验设计Table 1 Orthogonal experimental design

由表2可以看出，各因素对蔬菜复合可溶性膳食纤维提取率的影响大小顺序为：B（蛋白酶添加量）＞A（淀粉酶添加量量）＞D（蛋白酶酶解时间）＞C（淀粉酶酶解时间）。复合酶法提取蔬菜复合可溶性膳食纤维的最佳工艺为A2B2C2D2，即淀粉酶添加量200 U/g，蛋白酶添加量1125 U/g，淀粉酶酶解时间60 min，蛋白酶酶解时间60 min。通过进一步验证，在此条件下，蔬菜复合可溶性膳食纤维提取得率为4.97%，均高于其他试验组。

表2 正交试验结果Table 2 The result of orthogonal design

2.3 抗氧化活性

2.3.1 对DPPH自由基的清除能力

DPPH自由基是一种稳定的自由基，甲醇溶液显紫色，自由基清除剂能够与DPPH的单电子配对，在最大吸收波长处颜色变浅，吸光度也会随之变小，DPPH自由基清除率越高，表明其抗氧化能力越大。由图6可知，苦瓜、金针菇、魔芋、西蓝花与复合可溶性膳食纤维对DPPH自由基的清除能力随着可溶性膳食纤维质量浓度的增加而逐渐增大，在质量浓度为3 mg/mL时，复合可溶性膳食纤维清除率最高达到82.42%，高于其它4种单一组分。

2.3.2 对·OH自由基的清除能力

由图7可知，复合蔬菜可溶性膳食纤维对·OH自由基的清除能力随着可溶性膳食纤维质量浓度的增加而逐渐增大。复合可溶性膳食纤维在质量浓度3 mg/mL时清除率最高，可达57.97%，高于西蓝花、苦瓜、魔芋、金针菇这4种可溶性膳食纤维的清除率。

2.3.3 还原力

图8 可溶性膳食纤维总还原能力对比Fig.8 Contrast of total reducing ability of SDF from compound vegetables

由图8可知，苦瓜、金针菇、魔芋、西蓝花与复合可溶性膳食纤维均具有一定的还原能力，并随着可溶性膳食纤维质量浓度的增加而逐渐增大。且在一定浓度范围内，苦瓜、金针菇、魔芋、西蓝花四种单一组分的还原能力要高于复合组分，其中金针菇的还原力最强。

3 结论

通过正交试验方法优化了蔬菜复合膳食纤维的提取工艺，最佳工艺参数为淀粉酶添加量200 U/g，蛋白酶添加量1125 U/g，淀粉酶酶解时间60 min，蛋白酶酶解时间60 min。在此条件下，蔬菜复合可溶性膳食纤维提取得率为4.97%。

提取所得的蔬菜复合膳食纤维具有一定的抗氧化能力，在质量浓度为3 mg/mL时，复合可溶性膳食纤维DPPH自由基清除率、·OH自由基清除率分别为82.42%、57.97%，均高于金针菇、苦瓜、魔芋这3种单一可溶性膳食纤维。蔬菜复合膳食纤维具有一定的还原能力，且在一定浓度范围内，单一组分的还原能力要高于复合组分。