慢性牙周炎和IgA肾病大鼠模型的建立及其相关性初步分析*

王译凡 刘 娜 胡 巍 郝思维 迟晓培 郭 斌

近年来，多项研究均证明慢性牙周炎(chronic periodontitis，CP)引起的局部炎症可影响机体其他器官的宿主免疫反应[1,2]。慢性肾病(chronic kidney diseases，CKD)和慢性牙周炎有许多共同的危险因素，越来越多的流行病学研究和临床实验发现慢性牙周炎是慢性肾病的一个危险因素[3]。部分流行病学调查结果显示，中重度牙周炎患者的CKD患病率比牙周健康者高出2倍[4]，肾功能异常的患者牙周炎患病率是一般人群的2倍[5]。IgA肾病(immunoglobulin A nephropathy，IgAN)在慢性肾病中发病率较高，其发生发展与感染、粘膜免疫反应密切相关[6]。慢性牙周炎是口腔疾病中最常见的慢性感染性病灶，在IgA肾病的发生发展过程中是否起到促进作用是众多学者关注的热点。因此本研究将建立SD大鼠IgAN和慢性牙周炎的复合模型，系统探究慢性牙周炎与IgAN之间互相影响的关系。

1.材料与方法

1.1 实验动物与分组 6周龄SPF级Sprague-Dawley(SD)大鼠80只，雌雄各半，体重160～180g，由斯北福(北京)生物技术有限公司提供。于解放军总医院动物实验中心(许可证号SCXK(京)2016-0002)饲养，室温20～24℃，湿度20%，自由饮水、摄食。普通饲料适应性培养1周后随机分成4组，每组20只，雌雄各半。分别为正常对照组，慢性牙周炎组(CP组)，IgA肾病组(IgAN组)，慢性牙周炎+IgA肾病复合组(CP+IgAN组)。实验人员均取得动物实验上岗证。

1.2 实验用牙周致病菌 牙龈卟啉单胞菌(porphyromanus gingivalis，P.gingivalis)ATCC 33277株，伴放线放线杆菌(actinobacillus actinomycetemcomitans，A.actinomycetemcomitans)ATCC29523株，由北京中科质检公司提供。

1.3 动物模型建立和处理

1.3.1 正常对照组 正常饲养，生理盐水灌胃，皮下注射生理盐水0.4ml，频率同模型组。

1.3.2 CP动物模型建立 100μL的 2-4×1010CFU/ml的牙龈卟啉单胞菌和4-6×108CFU/ml的伴放线放线杆菌加入到2%的羧甲基纤维素钠CMC中配置细菌混悬液，腹腔麻醉大鼠，开口器固定大鼠头部暴露双侧上颌磨牙，探针分离牙龈，结扎丝结扎双侧上颌第一磨牙，如结扎丝脱落，随时结扎。细菌混悬液涂抹结扎线，隔一天一次，连续8次。

1.3.3 IgAN动物模型建立 参考李静等[7]的方法并加以改进，用蒸馏水配置BSA成100g/L，剂量400mg/kg，隔天灌胃，持续12周；皮下注射四氯化碳0.1ml+蓖麻油0.3ml，每周1次；第8周尾静脉注射脂多糖0.05mg。

1.3.4 CP+IgAN动物模型建立 在CP大鼠模型的基础上结合IgAN大鼠模型建立方法建立模型。

1.3.5 分别于8周末和12周末收集大鼠24h尿液；于建模第12周末处死大鼠，水合氯醛腹腔麻醉，取双肾置于组织固定液中，取大鼠双侧上颌骨，然后处死。

1.4 检测指标

1.4.1 大鼠一般状况 隔天称重，检查结扎丝脱落情况，观察大鼠进食及精神活动状况。

1.4.2 牙周临床指标 观察牙周色、形、质的变化，实验前、后由同一位口腔专业医生利用牙周细探针对SD大鼠检查记录龈出血指数和探诊深度，并根据X线检查和体视显微镜确定附着丧失。

(1)龈出血指数(sulcus bleeding index，SBI)：SD大鼠处死前，用探针轻探选用牙的牙周袋或牙龈沟10 S，记分标准为：0＝龈缘和龈乳头外观健康，轻探龈沟后不出血；1＝龈缘和龈乳头呈轻度炎症，轻探龈沟后不出血；2＝牙龈呈轻度炎症，有颜色改变，无肿胀或水肿，探诊后点状出血；3＝牙龈呈中度炎症，有颜色改变和轻度水肿，探诊后出血，血仍在龈沟内；4＝牙龈呈重度炎症，不但有色的改变，并且有明显肿胀，探诊后出血，血流出龈沟；5＝牙龈有色的改变，明显肿胀，有时有溃疡，探诊后出血或自动出血。

(2)探诊深度(probing depth，PD)：SD大鼠处死后，用细牙周探针探选用牙的牙周袋，每牙选近中颊、颊侧、远中颊3个点测量，取均值。

(3)附着丧失(attachment loss，AL)：大鼠处死后取牙槽骨经显微镜目镜大体观察各组骨吸收情况，使用图像分析软件精确测定附着丧失情况，即釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离，每颗牙测量颊侧和腭侧的近、中、远分别六个位点的附着丧失距离，取均值。

1.4.3 牙周病理检查 大鼠处死后，取牙槽骨福尔马林固定、脱钙，HE染色，显微镜下观察大鼠牙周病理改变。

1.4.4 肾脏病理检查和免疫荧光检查

(1)分离双肾，于组织固定液中固定肾组织24h后，常规脱水，石蜡包埋，常规病理切片，常规HE染色，同时采用PAS、Masson染色技术，按试剂盒说明进行操作，光镜下观察。采用半定量法评价肾小球硬化程度[8]，半定量法评价肾小管间质纤维化程度[9]。

(2)采用石蜡切片免疫荧光染色流程，评分时采用国际通用5级半定量法判定IgA沉积强度，评分标准为：低倍镜下不能显示、高倍镜下似乎可见为一，0分；低倍镜下似乎可见、高倍镜下可见为+，1分；低倍镜下可见、高倍镜下清晰可见为++，2分；低倍镜下可见、高倍镜下耀眼为+++，3分；高倍镜下刺眼++++，4分。

1.4.5 24h尿蛋白检测 于8周末和12周末大鼠禁食12h，代谢笼内收集24h尿液，采用考马斯亮蓝法检测尿蛋白含量。

1.5 统计学分析 采用SPSS统计软件分析处理实验数据，采用t检验及秩和检验比较组间差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 大鼠一般情况 如图1所示，大鼠建模过程中，正常对照组大鼠体重持续增长，精神状态佳。CP组、IgAN组、CP+IgAN组大鼠建模后较正常对照组体重增长缓慢，与正常大鼠相比差异无统计学意义，8周后IgAN组4只大鼠出现毛色偏黄变乱，精神不振，CP+IgAN组大鼠发现9只出现同样情况。

图1 大鼠体重变化趋势

2.2 牙周炎建模检测 建模后4周CP组、CP+IgAN组大鼠表现出现牙龈炎症，8周后部分大鼠结扎区可探及较深的牙周袋，临床可见红肿，探诊易出血，非结扎区牙龈无明显炎症表现。

2.2.1 大鼠牙周临床及病理表现 图2可见正常组大鼠牙龈呈粉红色，质坚韧，无牙槽骨吸收，病理切片显示附着上皮无病理表现，牙槽嵴顶无吸收，牙槽骨无吸收；CP组、CP+IgAN组大鼠牙龈呈炎症表现，色鲜红，探诊后出血，牙槽骨吸收明显，病理切片显示龈沟上皮糜烂，大量炎细胞浸润，牙槽嵴顶可见破骨细胞位于骨陷窝内，牙槽嵴顶及牙槽骨吸收明显。

图2 正常大鼠及牙周炎大鼠牙龈表现、牙槽骨吸收及牙周病理表现(HE染色×400)

2.2.2 大鼠牙周龈出血指数评分 图3可见正常对照组大鼠牙龈无明显异常，无探诊出血，CP组大鼠呈牙周炎表现，牙龈中度炎症，浅牙周袋形成，探诊后出血，血在龈沟内，IgAN组大鼠牙龈无明显异常，部分呈牙龈轻度炎症表现，探诊后点状出血，CP+IgAN组大鼠牙龈呈重度炎症，探及深牙周袋，探诊后出血，血流出龈沟。各组大鼠龈出血指数评分如表1所示，结果显示：CP组、CP+IgAN组SBI指数和正常对照组比较，P＜0.001；CP+IgAN组和CP组比较SBI指数有显著上升，P=0.003；IgAN组与正常对照组相比，P＞0.05。

2.2.3 大鼠牙周探诊深度结果 如表2结果所示，CP组、CP+IgAN组探诊深度均显著高于正常组，P＜0.001；同时，CP+IgAN组和CP组的探诊深度相比较，P＜0.001；IgAN组探诊平均深度高于正常对照组。

图3 各组大鼠结扎区牙龈

表1 牙周龈出血指数评分频数表(n=20)

2.3 肾病建模检测 于8周末和12周末大鼠禁食12h，于代谢笼内收集24h尿液，采用考马斯亮蓝法检测尿蛋白含量，比较各组8周末和12周末大鼠尿蛋白的变化，结果如表3所示：建模的8周后，IgAN组和CP+IgAN组相较正常对照组大鼠尿蛋白显著上升，差异有统计学意义，P＜0.05；CP+IgAN组尿蛋白含量比IgAN组高，P＜0.05；CP组和IgAN组比较尿蛋白含量差异无统计学意义，CP组和正常对照组比较尿蛋白含量差异无统计学意义。建模12周后，CP组、IgAN组和CP+IgAN组相较正常对照组大鼠尿蛋白显著上升，P＜0.05；CP+IgAN组尿蛋白含量比IgAN组显著增高，P=0.001。

表3 各组大鼠8周末和12周末24h尿蛋白量(mg/kg.24h，x.s)

2.4 处死后测定附着丧失 大鼠处死后取牙槽骨测定附着丧失情况，结果如表2：CP组、CP+IgAN组附着丧失程度通过软件精密测量、统计分析后发现平均数均显著高于正常组，P＜0.001；CP+IgAN组较CP组附着丧失增多，P＜0.001。

表2 探诊深度及附着丧失

2.5 处死后检测大鼠的肾脏病理及评分

2.5.1 肾脏病理表现 图4 PAS染色结果可见，光镜下正常对照组大鼠肾小球形态正常，未见明显异常改变；CP组大鼠切片可见大部分肾小球形态正常，偶见系膜轻度增宽；IgAN组大鼠切片可见肾小球肾小球多处系膜区系膜轻中度增生，间质炎细胞浸润，偶有系膜硬化、粘连；CP+IgAN组大鼠肾小球病变较IgAN组严重，系膜显著增生，可见不同程度肾小球局灶系膜硬化。

2.5.2 免疫荧光染色结果 如图4所示，正常对照组大鼠肾小球系膜区无免疫复合物沉积，即无荧光反应，CP组大鼠肾小球偶见弱荧光，IgAN组大鼠肾小球免疫复合物沿肾小球系膜颗粒状分布，IgA荧光低倍镜下可见，高倍镜下可见强度为+～+++，CP+IgAN组大鼠肾小球免疫复合物颗粒状或团块状分布，IgA荧光显著，可见明显IgA荧光沉积，荧光强度为++～++++。染色结果评分如表4，两两比较结果：CP组、IgA组、CP+IgAN组肾脏免疫荧光染色评分高于正常对照组，P＜0.001，提示大鼠肾组织IgA沉积；CP+IgAN组大鼠较IgAN组大鼠相比，染色评分显著上升，P=0.002。

图4 大鼠肾脏病理改变(PAS染色×400，IgA免疫荧光×400)

表4 免疫荧光染色评分频数

3.讨论

牙周炎是危害口腔健康的常见病和引起成人失牙的主要原因，在我国有较高的患病率。同时牙周炎也是最常见的慢性感染性病灶，与黏膜免疫相关，可引起全身炎性反应。牙周炎的始动因子是牙菌斑生物膜，口腔局部适宜的温度和营养条件为微生物的定植、生长、繁殖创造了有利地形，加上各种组织的局部反应，以及各种因素调节的宿主系统反应，决定了牙菌斑形成后的牙龈炎症进展为牙周炎，引起牙周袋的形成、附着丧失及牙槽骨的丧失。近年来，关于牙周炎和其他系统疾病影响的研究越来越多，比如牙周炎与冠心病[10]、糖尿病、肺部疾病、早产、肥胖等疾病具有相关性。大量流行病学研究和临床实验显示慢性牙周炎是慢性肾病的一个危险因素，有学者对慢性牙周病和慢性肾病的观察性研究进行meta分析[11]系统评价，结果显示，与非牙周炎患者个体相比，慢性牙周炎患者的慢性肾病发生率高60%，OR为1.60(95%CI：1.44-1.79)。还有研究发现牙周炎患者早期肾损害指标如胱抑素C升高。血透患者也会出现比较明显的牙周组织的破坏，牙周状况(包括菌斑指数、牙龈指数和牙石指数)随着透析治疗的时间变长变得更差[12]。

IgA肾病是我国最常见的慢性肾炎，在我国发病率占原发性肾小球肾炎的40%～47.2%[13]。明确诊断为IgA肾病的患者，有15%～20%的可能于10年内进展、30%～40%的可能于20年内进展为终末期肾功能衰竭[14,15]。IgA肾病的发病机制仍不明确，但目前有最新研究表明其与感染、粘膜免疫密切相关。牙周炎是目前已知的最常见的慢性感染性病灶，同全身健康密切相关，可能成为某些全身疾病的危险因素。慢性牙周炎可以不断局部产生炎性因子并进入血循环，同时有研究表明IgA肾病患者的血液中有牙周炎特定致病菌，且抗体滴度同病程进展相关[16,17]。

本研究建立了大鼠慢性牙周炎和IgA肾病复合模型。慢性牙周炎主要表现为炎症、牙周袋的形成、附着丧失和牙槽骨的破坏，IgA肾病主要表现为蛋白尿及肾组织活检可见系膜区IgA免疫荧光沉积。与正常组相比，牙周炎模型的成功建立可以观察到明显的牙周袋的形成、附着丧失及牙槽骨的吸收，IgA肾病模型的建立主要标准是可见明显的肾脏免疫荧光染色，而复合模型同时表现出牙周炎的临床及病理表现为深牙周袋的形成、附着丧失和牙槽骨的吸收，以及IgA肾病的临床病理表现：肾小球系膜区系膜增生，间质炎细胞浸润，以及最关键的免疫复合物沉积的荧光反应等。实验数据表明：在成功建模的基础上，CP+IgAN组的各项牙周临床指标，如龈出血指数、探诊深度与附着丧失，和CP组比较，上升幅度都具有显著差异，提示IgA肾病对牙周炎的发展可能有促进作用；CP+IgAN组的肾组织病理和免疫荧光评分也较IgAN组严重，表明牙周炎也可能促进IgA肾病的发生发展。同时，CP组的肾脏病理出现部分肾组织炎性改变，免疫荧光染色评分比正常对照组高，说明牙周炎可能影响肾脏病的发生；IgAN组大鼠的龈出血指数评分、探诊深度及附着丧失较正常对照组有一定的上升，部分大鼠出现牙龈炎甚至轻微的牙周炎，提示IgA肾病也可能会影响口腔内牙龈炎的发生。可以从此推断出：慢性牙周炎同IgA肾病之间有一定的互相促进的影响。慢性牙周炎与IgA肾病相关性的生物学机制尚不明确，有研究发现，与患牙周炎的健康人群相比，血透患者牙周病原菌的检出率更高[18]，牙周基础治疗可以降低血透患者的炎性标记物水平[19]。牙周炎致病菌可导致牙周的局部组织炎症，通过局部病灶的炎性因子产生如IL-1，IL-6，PGE2和TNF-α等炎性介质，以及部分细菌如牙龈卟啉单胞菌和其产物LPS的入血[20]，介导并加重全身慢性炎症状态损害肾脏，特征表现为C反应蛋白水平的增高。IL-1，IL-6，PGE2和TNF-α等炎性介质随着血流运输至肾脏组织，可以造成肾脏内皮细胞的损伤，形成肾脏血管动脉粥样硬化[21]，导致肾血流量的减少，进而造成肾小球硬化。而IgA肾病可能通过黏膜免疫反应及影响口腔卫生健康加重慢性牙周炎，引起牙周组织的病理性改变[22]。然而他们之间的因果关系还有待进一步阐述研究。

综上所述，慢性牙周炎可能同IgA肾病互相影响，这可为临床医师提供更多的参考。但本研究样本量不够大，限制了研究结果的可靠性，且本研究无法证明慢性牙周炎和IgA肾病之间的因果关系，需要更多研究进一步探索慢性牙周炎同IgA肾病之间的关系和相关机制。