脂联素对高糖条件下视网膜血管内皮细胞增殖、迁移和管腔形成的作用

李 蓉，姚国敏，王小娣，姚 杨

作者单位:(710077)中国陕西省西安市，西安医学院第一附属医院1眼科;2中心实验室

0 引言

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最严重且最常见的并发症之一［1］。在DM的进展过程中，高血糖导致慢性微血管损伤，使得约1/10的患者出现增生性DR(proliferative DR，PDR)或糖尿病性黄斑水肿，严重威胁患者视力［2］。随着生活水平的提升，DM的发病率逐年攀升［3］，但针对DR目前仍缺乏有效的治疗方法或药物。根据病程发展的不同阶段，DR分为早期的非增生性DR(non－proliferative DR，NPDR)和晚期的PDR［4］。PDR的标志就是形成视网膜新生血管，其血管结构非常脆弱且易渗漏，最终导致不可逆的视网膜损伤和盲目［2，5］。因此，抑制血管生成就成为了近年来具有前景的DR治疗策略［6］。

脂联素(adiponectin，APN)是由脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性蛋白质。临床发现血清APN浓度降低与肥胖和2型DM的发生有关，APN通过直接代谢和胰岛素增敏作用在各种组织中发挥有益的抗DM作用［7－9］。在缺血性视网膜病变的动物模型中发现，过表达APN可明显减少缺氧诱导的病理性视网膜新生血管，认为APN是视网膜病理性微血管形成的负向调控者，对视网膜血管损伤起着保护作用［10］。然而，目前对于血清APN 水平与 DR 的关系尚无定论［11－13］，APN 对高糖诱导的视网膜新生血管形成的作用也不清楚。鉴于此，本研究利用高糖刺激条件下的RF/6A细胞观察APN对其增殖、迁移及管腔形成过程的影响，为明确APN对DR的作用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料 恒河猴脉络膜视网膜血管内皮细胞(RF/6A细胞)购自武汉普诺赛生命科技有限公司;1640培养基、0.25%胰酶均购自美国Gibco公司;胎牛血清购自美国Invitrogen公司;青霉素、链霉素购自美国Hyclong公司;APN购自金斯瑞生生物科技有限公司;CCK－8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司;Transwell小室、Matrigel基质胶均购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组 将 RF/6A细胞置于1640培养基(含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和 100μg/mL链霉素)中，在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下常规培养。当细胞的密度达到80%时，用0.25%胰酶消化细胞，终止消化后收集细胞，用PBS将细胞润洗2次，1200r/min，离心3min，加入培养基吹打细胞，制成单细胞悬液，按1∶3的比例传代，37℃、5%CO2及饱和湿度条件下扩大培养。将RF/6A细胞分为空白对照组、甘露醇对照组、高糖组、高糖+APN组。处理方法:空白对照组细胞采用正常培养基培养;甘露醇对照组细胞采用含20mmol/L甘露醇的培养基培养;高糖组细胞采用含25mmol/L D－葡萄糖的培养基培养;高糖+APN组细胞采用含25mmol/L D－葡萄糖+10μg/mL APN的培养基培养。

1.2.2 CCK－8法检测细胞活性 将处于对数生长期的细胞消化后，配制成 5×104个/mL的单细胞悬液，每孔100μL，将细胞均匀接种至96孔板中，同时设置空白孔，周围孔加入100μL PBS，37℃、5%CO2饱和湿度条件过夜培养。按照分组条件处理48h后，向每孔加入 10μL CCK－8溶液，37℃ 培养 4h，振荡 10min，用酶标仪(美国Thermo scientific，MK3型)测定各孔在450nm处的吸光值(A)。细胞增殖率(%)=(A实验组－A空白孔)/(A空白对照组－A空白孔)×100%。

1.2.3 Transwell小室实验检测细胞迁移 取处于对数生长期的细胞，0.25%胰酶消化后，用1640培养基制成单细胞悬液，计数后按照每孔5×105/个细胞均匀接种至6孔板中，37℃、5%CO2饱和湿度条件过夜培养。按照分组条件处理48h，0.25%胰酶消化收集，1 200r/m，离心3min，去上清，PBS润洗2次，清洗掉残余血清。无血清培养基重悬细胞，细胞计数板计数，用无血清培养基稀释细胞浓度至2×105/mL，备用。在24孔板中加入800μL含10%胎牛血清的培养基，并放入Transwell小室，在Transwell上室分别接入200μL各组细胞悬液，37℃，5%CO2培养箱培养48h;取出Transwell用PBS清洗小室，用70%冰乙醇溶液固定细胞1h;用0.5%结晶紫染液染色，室温中放置20min，PBS清洗后用干净的棉球将上室一侧的未迁移的细胞擦干净，显微镜下观察拍照，每个小室随机选取5个视野，计数迁移的细胞。

1.2.4 Matrigel胶实验检测细胞管腔形成 于4℃过夜融化Matrigel胶，预冷24孔板和枪头，每孔200μL基质胶加至24孔板，低速无菌离心除去气泡，37℃孵育40min，取上述不同分组处理48h后的细胞，0.25%胰酶消化后，用无血清培养基制成单细胞悬液，计数后按照每孔2×105/个将细胞均匀接种至预铺有基质胶的24孔板中，37℃、5%CO2饱和湿度条件过夜培养后在显微镜下拍照。随机取3个视野(×100)照相，采用Image J图像分析软件计算完整管腔数(每3个分叉处记作1个血管腔)，取平均值。

统计学分析:本研究采用SPSS 17.0软件进行分析，数据以均数±标准差(珋x±s)表示，组间差异采取方差分析和LSD－t检验进行比较。P＜0.05为差异具有统计学意义。

图1 各组细胞增殖率比较 bP＜0.001 vs空白对照组;dP＜0.001 vs甘露醇对照组;fP＜0.001 vs高糖组。

图2 各组RF/6A细胞迁移情况(×200) A:空白对照组;B:甘露醇对照组;C:高糖组;D:高糖+APN组。

2 结果

2.1 APN促进高糖条件下的RF/6A细胞增殖 CCK－8实验结果显示，空白对照组(100.00%±0.00%)、甘露醇对照组(99.09%±0.46%)、高糖组(71.42%±2.29%)、高糖+APN组(90.87%±1.68%)细胞增殖率比较，差异具有统计学意义(F=254.16，P＜0.001)。空白对照组与甘露醇对照组细胞增殖率差异无统计学意义(P＞0.05)，提示高渗透压对细胞增殖无明显影响。高糖组细胞增殖率明显低于空白对照组和甘露醇对照组(均P＜0.001)，提示高糖培养条件下的细胞增殖受到明显抑制。高糖+APN组细胞增殖率明显低于空白对照组和甘露醇对照组(均P＜0.001)，而明显高于高糖组(P＜0.001)，提示 10μg/mL APN处理后细胞增殖较高糖培养条件下有所增强，但仍然低于正常水平，见图1。以上结果表明，高糖条件下细胞增殖低于对照组，APN对细胞增殖具有保护效应。

2.2 APN抑制高糖诱导的RF/6A细胞迁移 Transwell实验结果显示，空白对照组(121.60±6.02个)、甘露醇对照组(119.60±9.39个)、高糖组(144.20±9.65个)、高糖+APN组(73.00±6.04个)细胞迁移数比较，差异具有统计学意义(F=70.28，P＜0.001)。空白对照组与甘露醇对照组细胞迁移数差异无统计学意义(P＞0.05)，提示高渗透压对细胞迁移无明显影响。高糖组细胞迁移数明显高于空白对照组和甘露醇对照组(均P＜0.001)，提示高糖培养条件下细胞迁移明显增强。高糖+APN组细胞迁移数明显低于空白对照组、甘露醇对照组和高糖组(均P＜0.001)，提示10μg/mL APN处理后细胞迁移较高糖培养条件下有所减弱，且低于正常水平，见图2、3。上述结果表明，高糖条件可以明显诱导RF/6A细胞发生迁移，而APN作用后对高糖诱导的细胞迁移具有明显的抑制作用。

图3 各组细胞迁移数比较 bP＜0.001 vs空白对照组;dP＜0.001 vs甘露醇对照组;fP＜0.001 vs高糖组。

2.3 APN抑制高糖诱导的RF/6A细胞管腔形成Matrigel实验结果显示，空白对照组(12.11±0.84个)、甘露醇对照组(12.22±0.96个)、高糖组(16.00±2.90个)、高糖+APN组(7.89±0.38个)细胞管腔形成数比较，差异具有统计学意义(F=12.92，P＜0.001)。空白对照组与甘露醇对照组细胞管腔形成数的差异无统计学意义(P＞0.05)，提示高渗透压对细胞管腔形成无明显影响。高糖组细胞管腔形成数明显高于空白对照组和甘露醇对照组(均P＜0.05)，提示高糖培养条件下细胞管腔形成明显增强。高糖+APN组细胞管腔形成数明显低于空白对照组和甘露醇对照组(均P＜0.05)，也明显低于高糖组(P＜0.001)，提示10μg/mL APN处理后细胞管腔形成较高糖培养条件下有所减弱，且低于正常水平，见图4、5。上述结果表明，高糖条件可以明显诱导RF/6A细胞的血管形成，而APN作用后对高糖诱导的血管形成具有抑制作用。

3 讨论

高血糖是DM最基本的病理生理状态，在DM血管并发症的发生发展中起着重要作用。高血糖导致的血管渗透性增加，炎症和内皮细胞损伤是DR发生发展的基础［14］。本研究提示，高糖处理48h可以明显减少细胞增殖，导致细胞活力下降，与我们前期采用MTT实验获得的研究结果一致［15］。普遍认为，CCK－8检测的重复性可能优于MTT，结果变异率小，对细胞毒性小。高糖条件下培养的RF/6A细胞迁移和管腔形成能力明显较空白对照组及甘露醇对照组增强，提示高糖是刺激血管生成的直接因素，与文献报道一致［15－16］。

图4 各组RF/6A细胞管腔形成情况(×100) A:空白对照组;B:甘露醇对照组;C:高糖组;D:高糖+APN组。

图5 各组细胞管腔形成数比较 aP＜0.05 vs空白对照组;cP＜0.05 vs甘露醇对照组;fP＜0.001 vs高糖组。

研究表明，由脂肪细胞分泌的生物活性物质与多种代谢性疾病的发生和发展密切相关，其中APN已被证明与代谢综合征、DM及心血管疾病的发生呈负相关关系［17］。近年研究提示，APN主要作用于胰岛B细胞、血管内皮细胞、肝细胞、心肌细胞、脂肪细胞、免疫细胞等靶细胞［18］，通过多种复杂信号通路发挥抗炎、抗氧化应激、改善内皮细胞功能及调节血管新生的作用，从而影响动脉粥样硬化进展、保护血管内皮和心肌、调节微循环及血管新生［19－21］。血管新生是一个十分复杂的生物过程，涉及细胞增殖、迁移、完整的网络状血管形成等多个环节，各种血管生长因子和细胞因子参与其中。关于内皮细胞血管生成方面的研究提示，APN对血管新生具有双向调节作用:(1)在组织缺血状态下，APN可刺激血管新生，建立侧枝循环，改善缺血组织的血供。DM患者常因血管内皮受损、动脉粥样硬化而影响冠状动脉及外周肢体的血液供应，导致冠心病和肢体坏疽的发生。对该类患者进行血管内皮祖细胞或骨髓单核细胞移植，诱导其在缺血组织中分化而促使血管重建是一种全新的治疗方法［19］。关于该类细胞移植治疗的研究发现，APN可促进骨髓单核细胞的存活和增殖，接受细胞移植治疗者必须具有较高的血清APN水平才能有效诱导内皮祖细胞的分化，促进血管生成［22］。APN可通过激活腺苷酸活化蛋白激酶－内皮型一氧化氮合酶(AMPK－eNOS)信号通路发挥诱导人脐静脉血管生成的作用，在小鼠基质胶塞实验和兔角膜新生血管模型中，APN可刺激血管结构的生长［23］。此外，APN可以纠正APN基因敲除小鼠由于缺血应激诱导的血管生成受损［24］。在大脑中动脉闭塞的小鼠模型中发现，APN的过度表达明显促进了缺血损伤小鼠大脑的局灶性血管生成［25］。与上述研究结果相似，本研究结果表明，APN可以显著促进高糖条件下的RF/6A细胞的存活及增殖，提示APN对高糖导致的RF/6A细胞损伤起一定的保护作用。(2)APN可以抑制某些病理状态下新生血管的生成。研究发现，APN可以通过抑制冠状动脉内皮细胞和肿瘤细胞的迁移和增殖发挥抗血管生成效应［26－29］。缺氧导致的APN基因敲除小鼠病理性视网膜血管新生更为严重［10］。研究显示，给予氧诱导的视网膜病变小鼠腹腔注射重组鼠APN蛋白，APN可以通过激活内源性eNOS促进生理性一氧化氮生成，同时又能抑制活性氧簇(ROS)/活性氮簇(RNS)的产生，在缺血性视网膜病变进程中发挥视网膜血管的保护作用［29］。本研究发现，APN可以显著抑制高糖条件下的RF/6A细胞迁移和管腔形成，提示APN对病理刺激条件下的血管生成过程起抑制作用，与上述研究结果一致。

综上，APN在内皮细胞的血管生成过程中扮演着不同的角色，其促进或抑制效应可能与生理或病理条件、内皮细胞类型、APN浓度等有关。本研究观察APN对高糖条件下RF/6A细胞增殖、迁移和管腔形成的作用，结果提示APN可以抑制高糖对视网膜血管内皮细胞的损伤，并促进其修复，同时抑制病理性血管生成，但具体机制仍需进一步研究。目前，对DR尤其是PDR还缺乏完全有效的治疗方法或药物，本研究结果提示APN治疗DR可能是一种崭新的思路，进一步深入研究APN的具体作用机制和信号通路很有可为治疗PDR提供新方法。