猪鲜精17℃保存剂效果对比试验

刘鑫 崔茂盛 张丹 唐佩娟 付永利 张学炜 李千军*

（1，天津市畜牧兽医研究所300381；2，天津农学院300380；3，天津市动物疾病预防控制中心300402；4，天津市畜牧总站300402）

随着我国养猪业发展与种猪联合育种工作的需要，人工授精的普及，猪精液品质的控制及精液保存稀释剂日趋成为猪人工授精技术的核心[1]。就鲜精保存而言，我国大、中型养猪企业人工输精所用精液大多来自当天采集，或来自17℃存储1～2d的精液，如此短的精液存储时间必将给企业增加人力、物力和财力负担，而且猪场用的17℃恒温箱的温度极不稳定，给精液存储质量造成较大影响。随着我国生猪市场集约化和规模化发展，猪精液高效、长期保存技术越发重要。目前市场上价格稍低的猪鲜精17℃保存稀释剂，保存效果大都不稳定（2～5d 不等），而质量稍高的17℃保存稀释剂价格都偏高（14～20 元不等），给生猪养殖企业带来较重运行成本。因此，探索和研发成本低的高倍长效精液17℃保存稀释剂对生猪产业健康、快速发展具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

主要试剂：海藻多糖、果糖（上海源叶生物科技有限公司）、葡萄糖（天津市光复精细化工研究所）、青霉素、链霉素（山东鲁抗舍里乐药品有限公司）、碳酸氢钠、EDTA 等（sigma中国有限公司）、精子快速染液（南京建成生物科技有限公司）。

主要仪器设备：CASA 计算机自动辅助分析系统，相差显微镜（英国）、冰箱（河南新飞电器有限公司）、电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司）、电子天平（上海菁海仪器有限公司）。

1.2 精液保存剂的配制

试验组的药品为本课题组配制，两个对照组（对照一和对照二） 均为国内著名品牌，按照产品要求进行配制猪精液鲜精保存液。

1.3 精液处理方法

1.3.1 精液采集

采用手握法采集精液，将预热好的集精杯（35～37℃） 用灭菌滤纸盖好，收集中间段精液，边采集边过滤去除胶状物。在37℃下用显微镜检查常规品质，精子活力在0.7 以上、无异味、色泽为乳白色的精液，放入保温瓶采精室备用[2]。

1.3.2 精液稀释与平衡

精液取回采精室（室温25℃左右），暗处静置，测量精液和稀释液的温度，确保二者的温差为0.1～0.3℃。将自制常温精液保存剂（提前配好） 与对照组均按（保存剂：原精） 2：1 的比例缓慢加入到猪精液中，轻轻上下摇晃，使精液与稀释液充分接触，室温23～25℃下暗处静置平衡1h；然后置于l7℃恒温箱中保存，每12h 轻轻摇动1 次，防止精子沉淀[3]。

1.3.3 精子质量检测

精子质量检测指为有效保存时间、总存活时间和质膜完整性[4]，具体操作参考文献4，有效保存时间采用计算机辅助系统进行检测，总存活时间通过目测法进行观察，质膜完整性参考文献4 进行。

1.4 试验设计

本试验分为3 组，试验组的稀释液为课题组研发，对照组均采用国内著名品牌配制稀释液。每组试验重复3 次，本试验中精子活率大于0.7 保存时间为有效保存时间，精子无活性时保存总时长为总存活时间。

1.5 数据处理

试验数据先用Excel 进行前期处理，然后用SPSS17.0 进行方差分析和多重比较，数据以“平均值±标准差”表示。

2 结果分析

2.1 猪鲜精17℃常温保存不同稀释剂的保存效果

由表1 数据可知，课题组研发的猪精液17℃常温保存稀释剂在有效保存时间和精子总存活时间方面均显著高于对照一组稀释剂，而相对于对照二组，试验组显著提高了大白种猪精液有效保存时间和精子总存活时间（p＜0.05），其余各组差异均不显著（p＞0.05）。

表1 不同保存剂对猪精液保存时间的影响

2.2 不同稀释剂对保存过程中精子质膜完整性的影响

由表2 可知，在常温保存过程中，3种不同稀释剂在前3d对精子质膜完整性均有较好保护作用，3 组间差异不显著（p＞0.05）；保存到第5 天，课题组研发的保存剂和对照二组中精子质膜完整性显著高于对照一组（p＜0.05），但前2 组之间质膜完整性无显著性差异（＞0.05）；保存至第7 天，对照一、对照二和试验组中精子质膜完整性分别为49.94±3.08，58.83±2.22，72.86±2.62，精子质膜完整性在该3 组之间均存在差异显著性（p＜0.05）。

表2 不同保存剂对精子质膜完整率的影响

3 讨论

对照二组的稀释剂是我国17℃常温保存稀释剂市场上知名高端品牌，精液保存效果稳定，基本在5～10d，市场占有率较高，但价格也较昂贵，每升稀释剂18～22 元。对照一组选择了中长期稀释粉，一般保存时间在5～7d，也具有较高的市场占有率。因此，本试验选用该2 种市场率占有率较高的猪精液17℃常温保存稀释剂作为对照组，试验结果更加客观。研究表明，课题组自制猪精液常温保存剂，在精液17℃常温保存过程中精子有效保存时间，精子总存活时间和质膜完整性等指标，部分显著高于对照二组，均显著高于对照一组。在有效保存时间方面，稳定在7～10d，甚至更长，表明本课题研发的稀释剂对精子有较好的保护作用，这可能与本稀释剂中含有特殊质膜稳定性成分、较强的缓冲能力物质和适当的能量类物质组合有关。在质膜完整性方面，本课题组研发的稀释剂对精子质膜也具有显著的稳定作用，这可能与本稀释剂中缓冲物质和渗透压稳定性高有关，避免精子在保存过程中损伤质膜，进一步提高精子的有效保存时间和总存活时间。