大叶冬青叶中8种活性成分提取工艺研究

陈 颖，王存琴，汪 雷，郑 婷，郑述梁，黄 超

(皖南医学院 药学院，安徽 芜湖 241002)

大叶冬青(IIexlatifolia)又名苦丁茶，系冬青科冬青属常绿乔木，多分布于浙江、福建、广西等长江流域以南的地区[1]。现代化学成分及药理活性研究发现，大叶冬青含有三萜及其皂苷、黄酮、多酚等多种化学物质[2-3]，具有降血脂、降血糖、抗氧化等多种生物学活性[4-7]。由于中药的化学成分和作用机制复杂，虽有文献报道大叶冬青黄酮类成分的提取工艺[8]，但此方法主要针对黄酮类成分，应用范围有限。而对大叶冬青多酚类成分的提取工艺研究还未见报道，且大叶冬青多酚类化学成分具有显著的抗氧化活性[9]，具有深入研究的价值。因此本实验拟探讨大叶冬青叶多酚类化学成分的最佳提取工艺，选用大叶冬青叶指纹图谱中的8个主要活性成分的总峰面积和浸出物含量作为评价指标，采用正交设计方法优选出最佳提取工艺，为大叶冬青叶有效物质提取和质量控制提供理论参考。

1 材料

1.1 仪器与试剂 高效液相色谱仪Agilent Technologies 1260 Infinity Ⅱ(配二极管阵列检测器、四元泵、自动进样器)，KQ5200E型超声波清洗机(工作频率40 kHz，昆山市超声仪器有限公司)，AUW220D型1/10万电子天平(日本岛津)，色谱乙腈(德国，默克股份有限公司)，色谱甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司)，水为娃哈哈饮用纯净水。

1.2 试药 新绿原酸(PS13122601-1)、绿原酸(PS14050901)、隐绿原酸(PS14011403)、芦丁(PS160113-02)、异槲皮苷(PS13061301)、异绿原酸B(PS13111502)、异绿原酸A(PS13111501)和异绿原酸C(PS13110401)对照品均购自成都普思生物科技有限公司，实验用大叶冬青叶采自安徽省祁门县，经安徽中医药高等专科学校汪荣斌副教授鉴为为冬青科冬青属植物大叶冬青I.latifolia的叶。标本均存放于皖南医学院药学院。

2 方法与结果

2.1 试验设计 采用正交试验法对大叶冬青药材提取工艺进行优选。以甲醇浓度(A)、溶剂倍数(B)、提取温度(C)、提取次数(D)为考察因素，每个因素选取3个水平(见表1)，以大叶冬青叶中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C 8个指标性成分的总峰面积和浸出物含量为评价指标。

表1 大叶冬青叶提取工艺正交试验因素水平

2.2 HPLC含量测定

2.2.1 配制对照品溶液 精密称取对照品新绿原酸8.40 mg，绿原酸11.40 mg，隐绿原酸8.40 mg，芦丁22.9 mg，异槲皮苷3.90 mg，异绿原酸B 8.70 mg，异绿原酸A 4.45 mg，异绿原酸C 3.15 mg，分别置5 mL容量瓶中，用50%甲醇超声溶解并定容至刻度，作为单标对照品储备液。分别吸取1 mL至10 mL容量瓶中，50%甲醇定容至刻度作混合对照品溶液，浓度分别为0.168 g/L、0.228 g/L、0.168 g/L、0.458 g/L、0.078 g/L、0.174 g/L、0.089 g/L、0.063 g/L。4 ℃冷藏保存备用。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称定大叶冬青叶粉末(100目)2.0 g，精密称定相同的9份，根据L9(34)正交试验设计表采用超声提取法进行提取，每次提取时间50 min，滤过，所得提取液水浴蒸干分别以相应的提取溶剂定容至25 mL容量瓶作为样品溶液。

2.2.3 色谱条件 采用Agilent HC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；流动相为0.2%磷酸乙腈(A)-0.2%磷酸水(B)进行梯度洗脱，梯度洗脱程序：0～15 min，10%A；15～30 min，16%A；30～50 min，18%A；流速1.0 mL/min，柱温40 ℃，检测波长320 nm。在上述色谱条件下，样品中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C色谱峰的分离度>1.5，保留时间与对照品保持一致，混合对照品及大叶冬青供试品色谱图见图1。

1.新绿原酸；2.绿原酸；3.隐绿原酸；4.芦丁；5.异槲皮苷；6.异绿原酸B；7.异绿原酸A；8.异绿原酸C。

2.2.4 精密度试验 精密称定大叶冬青叶粉末2.0 g，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，重复进样6次，记录HPLC图。结果表明8个指标成分色谱峰相对保留时间的RSD均<1.44%，相对峰面积的RSD均<1.90%。

2.2.5 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h进行色谱分析。记录HPLC图，结果表明8个指标成分色谱峰相对保留时间的RSD均小于1.34%，相对峰面积的RSD均<1.64%。

2.2.6 重复性试验 取同批大叶冬青粉末6份，每份约2.0 g，精密称定，同法制备供试品溶液，重复进样6次，记录HPLC图。结果表明8个指标成分色谱峰相对保留时间的RSD均<1.86%，相对峰面积的RSD均<2.28%。

2.3 浸出物含量的测定 按照2.2.2项下步骤制备样品溶液，精密移取20 mL置已干燥至恒重并称重的蒸发皿中，在水浴上蒸干，于105 ℃干燥3 h，移置干燥器中，冷却30 min，迅速精密称定质量。

2.4 正交试验方案及结果 选择L9(34)正交试验表，以选择的8个指标成分总峰面积为最终评价指标，对其结果进行数据处理。大叶冬青叶8个指标成分的峰面积见表2。同时参考9组实验浸出物含量，对结果进行综合评价。分析结果见表3～5。

结合表4、5，对大叶冬青叶8个指标成分总峰面积和浸出物含量两个指标进行分析。在所选因素水平范围内，根据总峰面积指标的因素分析，影响大叶冬青叶提取工艺的因素依次为A>C>D>B，而在方差分析中，溶剂浓度和提取温度的差异有统计学意义，其中溶剂浓度为主要影响因素，溶剂倍数与提取次数对试验结果没有显著性影响。而在以浸出物为指标的因素分析中影响大叶冬青提取工艺的因素依次为A>B>C>D，且在其方差分析中A、B、C、D 4个因素差异无统计学意义。在以总峰面积为指标的直观分析中，A3>A2>A1，B3>B2>B1，C2>C1>C3，D1>D3>D2，选择A3B3C2D1为最佳提取条件，即提取溶剂为70%甲醇，溶剂倍数为50倍，提取温度为60 ℃，提取次数为1次，提取时间50 min。

2.5 工艺验证 根据正交试验筛选出的最佳工艺条件，进行3批工艺验证，结果见表6。根据优选出的大叶冬青叶最佳制备方法制备出的大叶冬青叶提取液中8个主要成分的峰面积均较高。正交试验所得结论与实际提取结果相符合，且结果稳定可信。

表2 HPLC色谱图主要峰峰面积

编号色谱峰峰面积新绿原酸绿原酸隐绿原酸芦丁异槲皮苷异绿原酸B异绿原酸A异绿原酸C13644.410323.53466.6875.8219.7505.81631.51922.023725.810008.93873.5814.8347.6831.11364.82172.133373.99179.04067.6740.0245.3961.21175.01814.944167.811981.24032.0985.0347.1805.12012.32948.153230.212095.13856.8987.2411.7665.22378.33073.564140.811187.43994.2882.3298.4818.31689.52592.774068.712344.33799.5936.4296.3499.91684.52481.083703.912069.63674.9986.7371.9637.92437.43065.993582.613824.23941.41111.4434.8700.22921.43361.9

表3 大叶冬青叶正交实验方案与总峰面积和浸出物含量表

表4 总峰面积与浸出物含量直观分析表

表5 总峰面积与浸出物含量方差分析表

表6 大叶冬青叶提取工艺验证

3 讨论

3.1 提取方法与溶剂的选择 比较了超声提取法和加热回流提取法的提取效率，结果显示超声提取法简单方便、易于控制，提取效率也相对较高。

分别以50%甲醇、70%甲醇、50%乙醇、70%乙醇、水为提取溶剂，其他提取条件相同的情况下，50%甲醇和70%甲醇提取液中各峰面积和分别高于50%乙醇和70%乙醇以及水，因此采用甲醇作为提取溶剂。

3.2 评价指标的选择 抗氧化作用是大叶冬青的主要功效之一，本文选用的新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C 8个指标性成分具有抗氧化、抗炎、抗菌等作用。浸出物含量是评价中药药效的另一重要指标，其含量的变化会影响有效成分的含量，并最终影响药物的药理作用。选用大叶冬青叶中8个指标成分的总峰面积和浸出物含量联合评价大叶冬青叶提取工艺更为全面。

本试验以大叶冬青叶中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C 8个主要活性成分的总峰面积和浸出物含量为指标，选择最佳提取工艺，考虑了各指标的协同效应，较单一指标确定最佳工艺更具有可靠性，同时也更加科学、有效、合理。本实验正交工艺方案简单方便，易于结果统计，通过工艺验证，优化后的提取工艺结果稳定可靠，可为大叶冬青的进一步研究开发提供理论参考。