pH对日本囊对虾的急性毒性初步研究

梁彩凤，刘建勇

(广东海洋大学水产学院，广东 湛江，524088)

日本囊对虾(Marsupenaeusjaponicus)是中国主要养殖对虾之一，其不仅耐低温、耐干能力强，且肉质鲜美、价格高，市场前景广阔[1-4]。目前，苗种生产所用的种虾绝大部分选自野生群体，未经严格的种质筛选与改良，所培育的苗种普遍存在生长较慢、发病率和死亡率高、抗逆性较差、养殖收益欠佳等问题，严重制约了日本囊对虾养殖产业的可持续发展[5-6]。水体pH是水产养殖中重要的环境因子之一，pH变化不仅改变氨氮、亚硝酸盐等环境因子间接影响生物生存，还直接对水产动物的代谢机能产生影响，显著影响水产动物的遗传基础、抗病力以及病原微生物的致病力[7-8]。近年来，由于酸雨和水污染影响，导致养殖水体pH波动较大[9]，开展鱼虾类有关pH胁迫的研究越来越受到国内外学者的重视[10-13]。已有研究表明，低pH胁迫对甲壳动物生长代谢[14]、存活[15]、抗氧化应激[16]和免疫防御[17-20]等方面的影响均十分显著，且不同种类影响程度存在明显差异。在低pH胁迫对虾类的毒性研究方面，中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)[21]、日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)[22]、凡纳滨对虾(Ltopenaeusvannamei)[23]和克氏原螯虾(Procambarusclarkii)[9]等研究较多，有关日本囊对虾耐低pH胁迫的研究较少。

对日本囊对虾的耐低pH胁迫开展初步研究，以确定pH对日本囊对虾的半致死摩尔浓度和半致死时间，为日本囊对虾的养殖及耐低pH品系选育提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 日本囊对虾

试验在广东湛江国联水产开发股份有限公司雷州市纪家二场进行。所用日本囊对虾亲本引自中国台湾海峡海域群体而培育的第3世代选育群体(G3群体)，120日龄，随机挑选健康活泼、规格整齐，平均体长(48.87±4.81) mm、腹节长(34.00±3.56) mm、体质量(1.35±0.38) g的幼虾420尾。其中，60尾用于预试验，360尾用于正式试验。试验前将全部对虾在试验池(面积25 m2，水深20 cm，底部未铺沙)暂养7 d，暂养期间少量投饲，试验前饥饿处理24 h。

1.1.2 主要药品与设备

HCl分析纯；NaOH分析纯。ATAGO手持式盐度计(精确度0.001) ，MAST ER-S/MILL α公司； TP350便携式微量溶氧分析仪，北京时代新维测控设备有限公司；pH-10笔式pH计，上海力辰科技有限公司。

1.2 低pH急性毒性试验

1.2.1 预试验

采用急性毒性试验，以HCl分析纯和NaOH分析纯分别配置成0.01 mol/L HCl和1 mol/L NaOH的母液与新鲜海水混合，用pH计进行pH校对配成不同pH海水。以自然海水(pH 8.0±0.1)为对照组，设5个pH梯度(3.5、4.0、5.0、6.0和7.0)，试验不设重复，每组放10尾对虾，在规格统一的100 L桶中注水20 L进行预试验，持续处理48 h。预试验期间不投饲，及时清理粪便，溶氧控制在6.0 mg/L。每2 h观察并调节海水pH(保持pH变化范围在±0.1之间)，每隔24 h记录试验虾的死亡数量(个体死亡标准以鱼鳃停止呼吸，心脏停止跳动为准)，并置换相应pH的新鲜海水。根据预试验结果，确定48 h内100%存活的最低pH和100%死亡的最高pH作为正式试验pH范围。所用海水为经沉淀、过滤、消毒的自然海水，盐度29.8，pH(8.0±0.1)，水温(28±0.5) ℃。

1.2.2 正式试验

由预试验确定试验pH范围为3.5～5.0。以自然海水[pH(8.0±0.1)]为对照组，根据预试验结果，按等对数间距法设定5个pH梯度(3.8、4.1、4.4、4.7和5.0)，每组2个平行，每平行放30尾对虾，在规格统一的200 L桶中注水30 L进行96 h持续试验。所用海水盐度29.8，水温(28±0.5) ℃，全程不投饲，及时清理粪便，溶氧控制在6.0 mg/L。每2 h观察并调节海水pH(保持pH变化范围在±0.1之间)，每隔24 h记录试验虾的死亡数量，并完全置换相应pH的新鲜海水。

1.3 数据统计分析

用软件Excel 2007初步处理数据，利用SPSS软件回归分析得日本囊对虾48、72和96 h的半致死摩尔浓度LC50及各pH梯度处理组的半致死时间LT50，并采用经验公式计算出安全摩尔浓度(SC)：SC=0.1 × LC50(96 h) 。

2 结果与分析

2.1 不同pH胁迫下日本囊对虾的行为观察

试验开始时，pH 5.0的对虾活动基本正常，与对照组活动情况基本相同，试验对虾大多静伏于实验桶底部，少数缓慢游动；随着胁迫时间延长，两组试验对虾活动情况仍然没有太大变化；胁迫72 h内无死亡。pH 4.7组试验开始时对虾反应较强，大部分对虾在水的上层不停游动，数小时后才伏于水底，胁迫24 h后出现死亡。而pH 3.8、pH 4.1、pH 4.4组，试验开始时对虾反应强烈，大部分对虾在水的上层或在桶边缘不停游动；2 h后虾活动减少，伏于水底，用玻璃棒触碰虾体，虾会迅速逃游；pH 3.8组，4 h后开始出现脱壳现象，虾活动开始减弱，游动渐渐缓慢，出现虾体变红或变白，用玻璃棒触碰虾体反应迟钝，对虾身体弯曲，侧卧水底，8 h后出现对虾死亡；pH 4.1组，10 h后出现脱壳，16 h出现死亡；pH 4.4组，15 h后出现脱壳，19 h出现死亡。死亡对虾，尾部蜷缩，附肢僵硬，经检查可见，对虾头胸甲鳃部出现明显白色斑点，鳃和肝胰腺损伤严重，肌肉发白。

2.2 不同pH胁迫日本囊对虾死亡情况

自然海水(pH 8.0±0.1)的对照组试验个体均能正常生活，无死亡个体出现。由此基本可认为不同试验组日本囊对虾个体死亡均为低pH胁迫所致。在相同pH下，日本囊对虾的死亡率随胁迫时间的延长而增加；在相同胁迫时间内，各组受试日本囊对虾死亡情况随水体pH的降低而增加。其中，pH 5.0时，受试个体72 h内未见死亡，96 h内死亡率仅为3.33%。pH 4.7时，受试个体在24 h后开始出现死亡，96 h内死亡率为16.67%。pH 4.4、pH 4.1、pH 3.8组，受试个体在胁迫24 h内即发生死亡，96 h内死亡率分别为50%、90%和100%(图1)。Pearson相关分析显示，pH胁迫96 h内，日本囊对虾死亡率与水体pH呈负相关(R<0，P<0.01)。

图1 不同pH对日本囊对虾死亡率的影响Fig.1 Effect of different pH on mortality ofMarsupenaeus japonicus

2.3 日本囊对虾不同时间的pH半致死摩尔浓度

利用SPSS19.0软件进行回归分析得，在溶氧6.0 mg/L、盐度29.8、水温(28±0.5) ℃的条件下，低pH对日本囊对虾胁迫48、72、96 h的半致死摩尔浓度分别为7.907×10-5、5.140×10-5和3.673×10-5mol/L，96 h的安全摩尔浓度为3.673×10-6mol/L，对应pH分别为4.102、4.289、4.435和5.435(表1)。

2.4 日本囊对虾不同pH的半致死时间

由表2可知，在溶氧6.0 mg/L、盐度29.8、水温(28±0.5) ℃的条件下，在水体pH 4.1、pH 4.4、pH 4.7时，日本囊对虾的半致死时间分别为58.821、93.771和139.549 h。

表1 日本囊对虾对低pH耐受性的半致死摩尔浓度Tab.1 Semi-lethal concentration of Marsupenaeus japonicus with low-pH stress

表2 各pH梯度处理组日本囊对虾的半致死时间Tab.2 Semi-lethal time of Marsupenaeus japonicus in pH gradient treatment groups

3 讨论

3.1 不同虾对低pH胁迫的耐受性比较

pH是衡量养殖水体水质的重要指标之一，pH过低会对水生生物的生长发育和生理状况产生直接或间接影响，甚至导致生物死亡[24]。研究发现日本沼虾幼虾[22]、脊尾白虾(Exopalaemoncarinicauda)[25]、凡纳滨对虾[26]幼虾和克氏原螯虾[9]的96 h LC50分别为4.48、4.78、4.04和3.67，而本研究中日本囊对虾在pH胁迫96 h后的LC50为4.4356，其对低pH胁迫的耐受性要优于日本沼虾幼虾和脊尾白虾，比凡纳滨对虾幼虾和克氏原螯虾稍差。说明日本囊对虾对pH没有显著的耐受能力；虾的种类不同，其对低pH胁迫的耐受程度也不同。本研究可丰富有关虾类对低pH胁迫耐受性的认识，为日本囊对虾的健康养殖及耐低pH品系选育提供依据。赵先银等[7]对中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)、凡纳滨对虾和日本囊对虾进行pH胁迫耐受性比较发现，日本囊对虾对低pH胁迫的耐受性比凡纳滨对虾强。然而，本试验结果与其测定结果不同。这可能与不同研究选用的群体、规格及测定环境条件不同有关。本试验的日本囊对虾采用中国台湾海峡群体，平均体长(48.87±4.81) mm，赵先银等[7]选用的群体平均体长较大，为(72.00±7.00) mm。日本囊对虾具有前期底栖生活、中后期潜沙生活的习性，随着日本囊对虾个体的生长，是否对低pH胁迫的耐受性显著增强，还有待进一步研究。

3.2 低 pH对日本囊对虾的毒害作用

根据已有研究，在低摩尔浓度pH刺激后，水体pH作为胁迫因子会刺激养殖生物产生应激反应，对机体调节和免疫防御产生压力[8,25]。本研究发现，在相同pH胁迫下，日本囊对虾的死亡率随胁迫时间的延长而增加；水体pH越低，受试个体出现死亡的时间越早，96 h内死亡率越高。pH 5.0时，胁迫72 h内未见对虾死亡，96 h内死亡率仅为3.33%；pH 4.7时，胁迫24 h后对虾相继出现死亡，96 h内死亡率升至16.67%；在pH 4.4、pH 4.1、pH 3.8胁迫下，对虾24 h内即发生死亡，96 h内死亡率迅速增加，甚至达到100%。其原因可能是低pH胁迫会对日本囊对虾呼吸、渗透调节和生理代谢等产生影响，可引起机体一系列防御应激调节。pH较高时，虾体防御功能在胁迫前期被诱导激活，能在短时间内发挥一定抵抗作用，抑制了pH对机体的损伤。但在胁迫后期防御系统受到一定抑制，个别受试个体自身调节难以抵抗低pH对机体的损伤而死亡，且pH越低，虾体依靠自身免疫起到的抵抗作用相对越弱。过低pH胁迫时，受试个体受到强烈的pH毒性毒害，日本囊对虾本身的固有防御体系已不能抵抗过低pH毒害，从而导致急性死亡，说明低pH对日本囊对虾有明显的毒害作用。由经验公式计算得日本囊对虾耐受低pH胁迫的安全摩尔浓度为5.435，建议在日本囊对虾实际养殖中，养殖水体pH如果接近或低于5.5，应引起注意并及时向养殖池塘洒入生石灰调节pH。

3.3 低pH胁迫对日本囊对虾器官形态结构的影响

本研究发现，低pH胁迫可引起日本囊对虾鳃和肝胰腺组织结构损伤。鳃是甲壳动物进行气体交换和离子调节的重要器官[27]，如果鳃组织的结构受损，气体交换的能力就会减弱，易造成组织缺氧。低pH胁迫会导致鳃组织损伤，可能导致日本囊对虾获氧能力的下降，致使组织缺氧。肝胰腺作为日本囊对虾重要的消化和代谢器官，具有脊椎动物肝、胰脏和肠道等的功能[28]。本研究发现，低pH胁迫可损伤日本囊对虾肝胰腺的形态结构，对肝胰腺内的正常分泌和代谢活动造成影响，引起肝胰腺代谢功能紊乱，进而可能导致虾体应激死亡。因此，在后期研究虾类耐受pH胁迫的分子机制时，可选用肝胰腺或鳃作为靶标器官。

在日本囊对虾低pH耐受试验过程中，各试验组海水的pH逐渐升高，这可能是日本囊对虾分泌物呈碱性而中和酸性环境的结果，也可能是对虾体内的酸碱平衡调节等酶类因酸性环境而被抑制，虾体排出大量碱性废物所致。这提示了虾类对pH胁迫的响应机制可从不同pH胁迫对各组织中酶活力的影响为突破口。

4 结论

初步研究了低pH对日本囊对虾的急性毒性，用回归分析方法分析pH对日本囊对虾的半致死摩尔浓度和半致死时间。结果显示：pH对日本囊对虾胁迫48 h、72 h、96 h的半致死摩尔浓度(LC50)分别为：7.907×10-5、5.140×10-5和3.673×10-5mol/L，安全摩尔浓度(SC)为3.673×10-6mol/L，对应的pH分别为4.102、4.289、4.435、5.435；水体pH 4.1、pH 4.4、pH 4.7胁迫日本囊对虾的半致死时间(LT50)分别为58.821、93.771 和139.549 h。结果表明，低pH对日本囊对虾有明显的毒害作用，会对鳃和肝胰腺的组织结构造成损伤。本研究为今后深入研究日本囊对虾的养殖、对低pH的耐受性及耐低pH品系选育提供参考。

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