糖尿病胰岛病变及胰岛β细胞胰岛素分泌损伤检测的整合实验相关经验探讨

张熠霖 皇晓燕 赵滢滢 舒兴盛 王子梅 应颖

摘要：胰岛素的生理作用及分泌调节是《内分泌系统》的重点内容，学生通过实验课的实践操作有助于加深对理论知识的了解。本文介绍了我院传统《内分泌系统》胰岛相关实验课程设置的缺点，及针对此进行的整合实验改革的内容及成果，并就存在的难点问题做了分析与探讨。

关键词：内分泌系统;糖尿病;胰腺;β细胞;胰岛素

中图分类号：G640;R587.1                                文獻标识码：B                          DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.01.006

文章编号：1006-1959（2019）01-0018-03

Experience in the Integration Experiment of Diabetic Islet Lesions and Islet β-cell Insulin Secretion Damage Detection

ZHANG Yi-lin，HUANG Xiao-yan，ZHAO Ying-ying，SHU Xing-sheng，WANG Zi-mei，YING Ying

（Health Science Center School of Basic Medical Sciences，Shenzhen University，Shenzhen 518060， Guangdong，China）

Abstract：The physiological function and secretion regulation of insulin are the key contents of endocrine system. The practical operation through experimental courses will be benefit to deepen the understanding of theoretical knowledge. This article introduces the shortcomings of the traditional islet related experiments of endocrine system in our school， as well as the contents and achievements of the integrated experimental reform carried out in this regard. We also discuss and analyze the difficult problems of existence.

Key words：endocrine system， diabetes， pancreas， β cells， insulin

《内分泌系统》是一门与临床医学息息相关的重要基础课程。而胰腺相关疾病里，糖尿病是一种由诸如环境因素、遗传因素、应激因素等多重因素引起的慢性非传染的代谢性疾病[1]。其发病机制是由于胰岛β细胞受损而引起胰岛素分泌减少、胰岛素受体减少或敏感性降低的一类自身免疫性疾病，是全人类慢性病中的一个重大难题[2]。有研究表明，糖尿病与阿尔茨海默症也具有一定的关联性[3]。之前的实验课程设置中，在内分泌系统胰岛相关的实验教学方面，基于8学时的课程要求，学生只进行了正常小鼠胰岛分离与胰岛素分泌刺激两部分实验，实验设置方面未涉及糖尿病胰岛病变和胰岛β细胞胰岛素分泌受损的检测，在胰岛相关教学上显得较为苍白，极大地限制了学生对于内分泌系统中胰腺常见疾病——糖尿病的全面了解。针对存在的问题，我们进行了整合实验改革，在同样有限的学时内，加入糖尿病模型鼠的实验组，并采用实验动手教学与多媒体教学相结合，深化学生对胰岛素正常生理作用及分泌异常导致糖尿病发生发展的发病机制的全面了解。在教学实践过程中，让学生通过：①了解糖尿病小鼠造模;②小鼠葡萄糖耐量实验与小鼠胰岛素耐量实验验证造模并分析;③分离小鼠胰岛观察葡萄糖糖刺激胰岛素分泌情况;④胰腺组织切片染色观察胰岛形态结构或胰岛素含量变化等一系列试验来强化学生对糖尿病发生发展的认知，加强了理论与实践的结合能力，促进了教学与科研的结合，也大大提升了教学效率，对学生日后的学习理解起到良好的促进，有利于今后的综合发展。

1整合实验改革内容

1.1课前准备  此项要求教师及实验技术助理有较好的专业技能和长时间的准备。

1.1.1糖尿病造模  糖尿病鼠造模常规为链脲佐菌素STZ造模和高脂饲养造模。因STZ鼠造模会损伤胰岛β细胞[4]，大量降低后面胰岛分离所得数量，我们采取高脂造模，采用4周龄的小鼠于清洁动物房高脂饲养12周。此部分由教师及实验员实验前期提前准备。

1.1.2饥饿处理与试剂准备  在做胰岛素耐量实验IPITT和口服葡萄糖耐量实验OGTT之前饥饿小鼠8 h，准备好注射要用的胰岛素溶液与葡萄糖溶液。

1.1.3制作胰腺石蜡切片及免疫荧光染色，图片储存用于多媒体教学展示  造模成功以后，杀鼠取胰腺在多聚甲醛中固定72 h，做脱水包埋。切5 μm薄片做免疫荧光染色。免疫荧光染色法标记insulin和DAPI，以检测胰岛素的分泌情况。将拍好的图片制成PPT用于课堂多媒体教学的展示，使学生掌握正常及糖尿病小鼠胰岛的镜下结构，胰岛素含量及分泌的差异，观察对理论知识的掌握。

1.1.4分离胰岛[5]  此部分由教师和学生分别完成。教师在实验前1 d分离胰岛并过夜培养，为学生第2天的葡萄糖刺激胰岛素分泌实验做好准备;学生在实验当天练习胰岛的原代分离，掌握胰岛的分离方法及观察胰岛的光镜下结构。

1.2实验操作过程

1.2.1第1～2学时  胰岛素调节血糖的生理作用及胰岛素分泌调节检测：①体重称量：称每只小鼠对应体重，按编号记录;②IPITT[6]：分对照组和糖尿病DM组，按小鼠体重注射相应的胰岛素量，测量两组小鼠胰岛素耐量，根据数据绘制对应曲线图，分析对比;③OGTT：分对照组和DM组，按小鼠体重注射对应葡萄糖量，测两组小鼠的糖耐量，根据数据绘制对应曲线图，分析对比;④测空腹胰岛素含量：用毛细管采眼球血100 μl，静置20 min，5000 g离心15 min，取血液上清放-80 ℃备用。

1.2.2第3～5学时  胰岛分离及结构观察。显微镜镜下观察与多媒体教学相结合，观察胰岛结构：①分离胰岛：处死小鼠后给胰岛点注射胶原酶P，消化后沉淀分离，体式显微镜下观察两组小鼠的胰岛形态并作比较;②倒置荧光显微镜下观察老师制备好的免疫荧光染色片子，让学生找出胰岛并观察两组胰岛的区别;观察对照与糖尿病组胰岛素的分布和含量的变化;③多媒体播映前期教师拍摄的免疫荧光染色图片，加深对糖尿病胰岛病理改变的理解。

1.2.3第6～8学时  葡萄糖刺激胰岛素分泌检测：挑取老师课前1 d准备的数量相同，大小差异不明显的胰岛放入24孔板中，做糖刺激胰岛素分泌实验。收上清与前期实验收集的空腹血清，ELISA法检测胰岛素含量。

2整合实验所取成效

2.1加强学生对糖尿病胰岛形态结构和生理功能改变的全面了解  通过实验整合后的学习，学生从以往单纯片面地对正常小鼠胰岛分泌情况有所了解，过渡到对正常小鼠与糖尿病小鼠的外观形态、胰岛素耐量、糖耐量、胰岛形态变化、胰岛素分泌情况等有了全面深刻的理解，并且因为有了正常与疾病小鼠的对比，使学生对生理条件下和糖尿病疾病条件下的胰岛差异有了更加清晰明确的认知。

2.2实践教学与多媒体教学结合，更加生动全面  在8个学时有限的时间内，通过教师充分的实验课前准备，用多媒体展示免疫荧光染色，更加直观生动地展示正常鼠与糖尿病鼠胰岛素的分泌差异;并且漂亮的图片也能吸引学生的注意力，提高课堂教学效率。这种多媒体展示与他们的动手实践相结合，使其更为全面的了解两种小鼠的胰岛特征与差异。

2.3学生的实验技术学习更全面  本实验课程不仅涉及到以往传统的胰岛分离和糖刺激胰岛素分泌检测，并且结合了IPITT、OGTT、眼球毛细管取血等技术，学习了解了免疫熒光染色的相关知识，让学生在有限的时间内多动手动脑，系统的掌握胰岛的组织学及生理、病理学相关实验，提高动手能力，为以后打下坚实的科研基础。

2.4加深学生对课本理论知识的理解  课本知识相对抽象与乏味，通过实验前基础知识的理解结合课程过程动手实践相结合，使相关知识具体化、直观化，促进学生对知识点的理解记忆，并能在以后的生涯中起到一定的指示作用。

3整合实验的难点与存在问题

3.1对授课教师和实验技术员要求较高  因为课前准备实验较多，需要授课教师与实验技术人员花费较多时间准备，由于老鼠较多，在糖刺激分泌实验前1 d 分离胰岛需要花费大量的时间。尤其在老鼠造模阶段更需要花费大量时间精力。并且教师与实验技术员需要熟练掌握小鼠造模、小鼠毛细管眼球取血、小鼠胰腺组织的摘取固定与脱水包埋、胰岛分离与胰岛培养等技术，并需把握好饥饿处理时间，提前配制好胰岛素溶液与葡萄糖溶液，保存血液上清等。这些课前准备的任务过重可能也需要更多的实验专业技术人员的配备。

3.2小鼠需要数量较多  整个实验课程下来，不仅需要对照组老鼠，并且糖尿病鼠造模需要较多的老鼠，在做IPITT与OGTT以及眼球毛细管取血中可能会由于学生操作不当造成老鼠死亡，以至于老鼠的消耗量上升。

3.3老鼠的饲养周期延长  因需要小鼠造模，所以购买回来的小鼠饲养周期大大延长，期间小鼠的饲养与管理难度加大，将占用大量空间，花费更多的人力、物力。

3.4时间相对紧迫  实验安排非常紧凑，多项实验需同时进行，不仅对教师的全体把控提出要求，也对学生的时间控制，动手能力，以及课前实验相关基础知识的了解有一定要求，动手能力差，不会把控时间的学生可能会在课时内完不成完整的实验，需要教师，实验技术员在课程中引导与帮助。也由于时间关系，实验原理需要学生课前有预习，老师做适量讲解以缩短课时时间的花费。

4总结

通过对内分泌系统中与胰腺相关的组织胚胎学、生理学、病理学各实验的有效整合，尽管增加了诸多复杂性，难度系数大大上升，但其能使此项实验教学更加全面直观生动，增强学生自主学习能力与全面动手能力，提高学生实验学习效率，即提高了教学效率与教学效果。

参考文献：

[1]王敏.糖尿病发病机制的研究进展[J].铜陵职业技术学院学报，2016，15（1）：43-44.

[2]陶桂香，徐洋.1型糖尿病发病机制及治疗研究[J].中国免疫学杂志，2015，31（10）：1297-1303.

[3]赵晶，娄培安，陈培培，等.2型糖尿病合并老年痴呆的患病现况及影响因素[J].中国老年学杂志，2015，35（10）：2796-2798.

[4]冯润，蒋思旸，吕晓锋，等.动物模型在糖尿病研究中的选择与应用[C]//中国北方实验动物科技年会，2017.

[5]颜迪恩，周迎生，高秀莹，等.小鼠胰岛分离纯化方法研究[J].器官移植，2015，6（2）：111-115.

[6]Xu F，Liang FX，Chen R，et al.Eelectroacupuncture improves insulin sensitivity in high-fat-diet-infuced insulin resistance rats via activation of SIRT1 AND GLUT4 in quadriceps femoris[J].Journal of Integrative Medicine，2014（3）：231-232.