黄皮果果胶的提取工艺优化及理化性质分析

廖雪华，欧阳佩佩，叶 华，2，王 盼，吴科锋，2*，李文德

（1.广东医科大学 广东天然药物研究与开发实验室，广东 湛江524023；2.广东医科大学 南海海洋医药研究院，广东 湛江524023；3.广东省实验动物监测所，广东 广州510000）

芸香科（Rutaceae）植物黄皮（Clausena lansium）是两广地区极常栽培的水果作物，其果实饱满、酸甜适中，是岭南特有的季节性佳果[1-2]。但黄皮果季节时效强，保鲜周期短，每年因天气、储藏或采摘不当而废弃的鲜果数以千吨计[3-4]。

果胶是一种以α-1,4糖苷键连接半乳糖醛酸组成的高分子多糖，存在于植物的果实、根、茎和叶等部位[5-6]。因其具有良好的增稠、胶凝化、乳化稳定等的特性，被广泛应用于食品、药品及化妆品等多个领域，具有较高的经济价值[7-11]。此外，果胶还具有良好的生理和药理活性，如降糖、降脂、抑癌和调节机体免疫等作用[12-13]。目前全球对果胶的年需求量以每年10%的速度递增，且国内食用级果胶的产能受制于原料问题，大部分需要靠进口解决[14-15]。黄皮中富含机酸、果胶、生物碱、黄酮等多种活性成分，具有重要的营养价值和药用价值[16-17]。目前，黄皮的深加工产品仅为果干、果脯、果汁及果酒等，但这些产品所需黄皮果为优等果才有较好的经济价值，无形中也占用了黄皮果的优质资源，不利于增加黄皮果产品附加值[18]。有研究报道[19]，采用微波辅助酸提取法制备黄皮果果胶，在不考虑果胶纯度的情况下，粗果胶的产率仅为3.59%，不利于黄皮果果胶的商业化开发。

目前工业化生产果胶的方法主要有酸提取法、离子交换树脂法、酶法、微波辅助提取法和超声辅助提取法等，在制备工艺和果胶质量上互有优劣[20-22]。为了有效对黄皮果废果进行二次开发，前期研究发现黄皮果干基，其粗果胶含量约为20%～28%，总糖含量＞70%，是制备高品质果胶的理想原料，若利用黄皮果废果生产果胶，将会极大增加黄皮果产业的附加值。本研究充分结合当地的实际情况和黄皮果的原料特征，在超声波预处理的基础上，采用传统酸提取法提取果胶，通过单因素试验及正交试验优选提取黄皮果胶的最佳工艺参数，为开发利用黄皮果果胶资源提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄皮粉末：将购自广东茂名的黄皮，除核，洗净，蒸馏水中浸泡2 h（脱除小分子糖类和部分色素），沥干，置于沸水浴中灭酶3 min，置于烘箱中进行干燥后，粉碎，过20 目筛，密封贮藏，备用；D-半乳糖醛酸标品（纯度≥97%）：美国Sigma公司；柠檬酸、盐酸、硫酸、无水乙醇（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

HX-200高速中药粉碎机：浙江省永康市溪岸五金药具厂；DK-98-Ⅱ电热恒温水浴箱：天津市泰斯特仪器有限公司；DZF-6090真空干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；AUW120D型电子分析天平：日本Shimadau公司；KQ-250DE型超声波清洗器：昆山超声仪器有限公司；LD-UPW-VF超纯水机：上海砾鼎水处理设备有限公司；Epoch酶标仪：美国Bio-Tek公司。

1.3 方法

1.3.1 黄皮果胶的提取工艺流程

称取干燥黄皮粉末5.0 g，放入500 mL 烧杯中，加入一定量的蒸馏水，搅拌，用盐酸溶液将pH调至2.0，在超声波功率250 W、超声频率40 kHz的条件下预处理30 min，采用热回流方式进行提取，热抽滤，收集滤液，冷却至室温后，加入0.5%提取液质量的活性炭，80 ℃脱色20 min，过滤。滤液蒸发浓缩至原体积的50%，静置冷却，在不断搅拌下加入1.5倍体积的无水乙醇。将果胶醇沉溶液置于25 ℃中静置90 min，离心分离，收集沉淀，依次用无水乙醇、体积分数为90%、80%、70%、60%的乙醇溶液洗涤，离心收集沉淀，冷冻干燥，即得黄皮果胶。

1.3.2 果胶含量的测定

采用咔唑-硫酸法测定果胶含量。半乳糖醛酸标准曲线的绘制：取6支离心管，分别加入质量浓度为0.6 mg/mL半乳糖醛酸标准品溶液0、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL，并分别加蒸馏水稀释到50 μL，于冰水浴中沿壁缓缓加入300 μL浓硫酸，混匀后沸水浴中加热25 min，迅速冷却至室温，再分别向离心管中加入10 μL 0.15%咔唑-乙醇溶液，混匀，放置120 min后，在波长530 nm条件下，测定其吸光度值，以半乳糖醛酸质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标绘制标准曲线。按照标准曲线回归方程y=0.002 9x+0.059 9（R2为0.995）计算样品中半乳糖醛酸含量，其计算公式如下：

式中：X1为果胶样品中半乳糖醛酸含量，%；C为按标准曲线回归方程计算半乳糖醛酸质量浓度，μg/mL；D为稀释因数；W为样品质量，mg。

纯果胶含量计算公式如下：

式中：X2为黄皮果中纯果胶含量，g；X1为果胶样品中的半乳糖醛酸含量，%；W1为冷冻干燥后粗果胶的质量，g。纯果胶得率计算公式如下：

式中：p为纯果胶得率，%；X2为黄皮果中的纯果胶含量，g；W2为样品黄皮的质量，g。粗果胶得率计算公式如下：

式中：X3为粗果胶得率，%；W1为冷冻干燥后粗果胶的质量，g；W2为样品黄皮的质量，g。

1.3.3 果胶胶凝度的测定[23-24]

准确称取3.00 g果胶置于250 mL烧杯中，加31 mL蒸馏水，搅拌溶解果胶，加入35.7 g白砂糖使之溶化，浓缩至总质量54.7 g。烧杯中加入12.5%柠檬酸溶液1 mL，然后倒入上述果胶糖液，用玻棒迅速搅拌均匀后罩上一只稍大烧杯，室温静置24 h，取出果冻，调向装入另一烧杯中（注意勿使果冻破裂），采用破碎压力计算法测定黄皮果胶的胶凝度，其计算公式如下：

式中：G为果胶胶凝度，g/cm2；S为制作果冻时所用的白砂糖

量，g；m为制作果冻时所用的果胶量，g；A为滴定水量，g。

1.3.4 提取条件优化单因素试验

分别在不同的提取溶剂（0.01 mol/L盐酸、0.05 mol/L硫酸、0.135 mol/L柠檬酸），液料比（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL∶g）），提取温度（60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃），提取时间（60 min、90 min、120 min、150 min、180 min），初始pH值（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0）条件下提取黄皮果胶，提取液经过浓缩、沉淀、离心、干燥后称取粗果胶质量，测其半乳糖醛酸含量，考察不同的单因素对纯果胶得率的影响。

1.3.5 提取条件优化正交试验

在单因素试验的基础上，以黄皮纯果胶得率为考察指标，选取提取温度（A）、初始pH值（B）、提取时间（C）、料液比（D）进行4因素3水平L（934）正交试验，其因素与水平见表1。

表1 提取工艺优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for extractio n technology optimization

1.3.6 黄皮果胶品质分析

水分含量：参照GB 5009.3—2010《食品中水分的测定》[25]中的直接干燥法；总半乳糖醛酸、酰胺化度、酸不溶灰分参照国标GB 25533—2010《食品添加剂果胶》[26]；二氧化硫：参照国标GB/T 5009.34—2016《食品中二氧化硫的测定》[27]滴定法；铅：参照国标GB 5009.12—2017《食品中铅的测定》石墨炉原子吸收光谱法[28]。

2 结果与分析

2.1 提取工艺优化单因素试验

2.1.1 提取溶剂对纯果胶得率的影响

本试验选用了0.01 mol/L盐酸、0.05 mol/L硫酸和0.135 mol/L柠檬酸作为提取剂[29-30]，考察其对黄皮纯果胶得率及胶凝度的影响，结果分别见图1和图2。

图1 不同提取剂对纯果胶得率和粗果胶得率的影响Fig. 1 Effect of different extraction solvents on the yield of pure pectin and crude pectin

图2 不同提取剂对果胶胶凝度的影响Fig. 2 Effect of different extraction solvents on the gelatinization of pectin

由图1可知，不同的提取剂对纯果胶得率有一定的影响，柠檬酸提取黄皮果胶，其粗果胶得率最高为7.82%，但以半乳糖醛酸含量计，纯果胶得率仅为2.89%；而盐酸提取黄皮果胶，尽管其粗果胶得率最低仅为6.52%，纯果胶的得率最高为4.96%。由图2可知，柠檬酸提取的果胶胶凝度最低仅为81.12 g/cm2，而盐酸提取的果胶胶凝度最高，达128.03 g/cm2。因此，综合考虑，选择0.01 mol/L盐酸作为最适黄皮纯果胶提取剂。

2.1.2 液料比对纯果胶得率的影响

图3 不同液料比对纯果胶得率的影响Fig. 3 Effect of different liquid and material ratio on extraction yield of pure pectin

由图3可知，当液料比为10∶1～20∶1（mL∶g）时，黄皮纯果胶得率随之增加；当液料比为20∶1（mL∶g）时，黄皮纯果胶提取效率达到峰值，得率为5.56%；继续增大液料比，纯果胶得率有所降低，但变化趋势不明显，后趋于平稳。原因是当提取效率达到峰值后，继续增大提取液用量，可降低溶液中的果胶浓度，使得醇沉时无法充分析出，也会增加过滤和浓缩时间，反而使纯果胶的得率下降。因此，液料比选择20∶1（mL∶g）为宜。

2.1.3 提取温度对纯果胶得率的影响

图4 不同提取温度对纯果胶得率的影响Fig. 4 Effect of different extraction temperatures on extraction yield of pure pectin

由图4可知，随着提取温度在60～90 ℃范围内的升高，黄皮果纯果胶的得率呈明显上升趋势，在提取温度达到100 ℃后，纯果胶得率最高为6.44%，而90 ℃时的纯果胶得率为6.29%，两者相比差异不明显。因此，提取温度选择90 ℃为宜。

2.1.4 提取时间对纯果胶得率的影响

图5 不同提取时间对纯果胶得率的影响Fig. 5 Effect of different extraction time on extraction yield of pure pectin

由图5可知，提取时间在60～150 min内，黄皮纯果胶得率随提取时间的延长缓缓增加，但增幅不大；在提取时间150 min时，纯果胶得率达到最大为5.29%，而180 min后，纯果胶得率有所下降。可能是因提取时间的延长，果胶在热水和酸的作用下，发生水解所致。因此，提取时间选择150 min为宜。

2.1.5 初始pH值对纯果胶得率的影响

图7 不同初始pH值对纯果胶得率的影响Fig. 7 Effects of different initial pH values on extraction yield of pure pectin

由图6可知，初始pH值为1.0～2.0时，纯果胶得率随之增加，并在初始pH值为2.0时达到峰值，为5.05%，其后随着初始pH值的增高而逐渐下降，这说明选择合适的H+浓度是提高纯果胶得率的关键因素。初始pH值过低可使果胶分子内的甙键和酯键发生断裂，水解成小分子；而在酸性条件下，初始pH过高则易使果胶转化为果胶酸，溶解性增加，使收率降低密切相关。因此，选择初始pH 2.0为宜。

2.2 提取工艺优化正交试验

在单因素试验的基础上，以黄皮纯果胶得率为考察指标，选取提取温度（A）、初始pH值（B）、提取时间（C）、料液比（D）进行4因素3水平L9（34）正交试验，正交试验结果与分析见表2，方差分析见表3。

表2 提取工艺优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for extraction technology optimization

由表2可知，各因素影响纯果胶得率的主要顺序为提取温度（A）＞液料比（D）＞初始pH（B）＞提取时间（C）。最佳组合为A3B2C1D2，即提取温度为90 ℃、液料比为20∶1（mL∶g）、初始pH值为2.0，提取时间为120 min。在此最佳工艺条件进行3次平行试验，纯果胶的平均提取率为6.84%。

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal tests results

由表3可知，因素A的F值为21.63＞F0.05临界值19.0，对结果影响差异显著（P＜0.05），说明因素A（提取温度）是影响黄皮纯果胶得率的关键性因素，而其他3个因素的影响无显著差异（P＞0.05）。

2.3 黄皮果果胶制品质量分析

参照果胶强制标准GB 25533—2010《食品添加剂果胶》中涉及的方法对提取的果胶进行检测。

由表4可知，黄皮果胶的各项指标都达到了国标GB 25533—2010《食品添加剂果胶》的相关要求，结果表明黄皮果胶品质较好。

表4 黄皮果胶质量分析结果Table 4 Results of quality analysis of pectin from wampee fruit

3 结论

以黄皮果为原料，利用超声波进行破壁预处理后，采用盐酸热回流提取法制备黄皮果果胶，通过单因素试验和L（93）4正交试验优化提取工艺。结果发现，以0.01 mol/L盐酸为提取黄皮果果胶的最佳提取溶剂，优化提取工艺条件为提取温度90 ℃、液料比20∶1（mL∶g）、初始pH值为2.0，提取时间120 min。在此最优工艺条件下，黄皮果纯果胶得率可达6.84%，半乳糖醛酸含量为76.51%。该工艺条件下所得的黄皮果果胶各项指标均达到GB 25333—2010《食品添加剂果胶》要求，说明提取工艺参数可行，果胶质量可靠。