林下山参不同部位的人参总皂苷与单体皂苷的含量分析
2019-03-08朱海林林红强谭静王涵岳乐乐李平亚刘金平
朱海林,林红强,谭静,王涵,岳乐乐,李平亚,刘金平※
(1.吉林大学药学院天然药物研究中心,长春 130021;2.吉林人参研究院,长春 130021)
人参(Panax ginseng C.A.Mey.)为五加科人参属多年生宿根草本双子叶植物,是我国传统的名贵中药,享有“百草之王”美誉[1]。栽培的俗称“园参”;播种在山林野生状态下自然生长的称“林下山参”(Mountaincultivated ginseng,MCG),习称“籽海”[2]。人参具有大补元气、安神益智的疗效[3]。现代药理学表明,人参具有抗氧化、抗自由基损伤、抗癌等多种药理活性[4]。皂苷作为人参的主要功效成分,是评价其质量的重要指标之一。按苷元结构类型不同,可分为原人参二醇型皂苷(Ra1、Ra2、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd 等)和原人参三醇型皂苷(Re、Rg1、Rg2、Rh1 等)。
有关园参对不同产地、不同部位的皂苷含量测定报道很多[5-7]。但有关林下山参不同部位的皂苷含量未见报道。为探讨林下山参不同部位中总皂苷和单体皂苷的异同,本试验分别采用紫外-可见分光光度法及紫外检测器-高效液相色谱(HPLC-UV)法对吉林产林下山参根、茎、叶和籽中的总皂苷及12种单体皂苷(元)进行测定,为全面分析林下山参各部位的皂苷含量提供数据支持,也为更好地开发利用林下山参地上及地下部分提供参考。
1 材料
林下山参采于吉林省抚松市(批号:20171010)、吉林省通化市(批号:20160809)和吉林省靖宇市(批号:20161007),由吉林大学天然药物研究中心李平亚教授鉴定为12年生林下山参。取植物全株,人工分离根、茎、叶和籽4 个部位,置阴凉处干燥。人参皂苷(元)Rb1(批号:110704-201625)、-Rb2(批号:111715-201203)、-Rb3(批号:111686-201504)、-Rd(批号:111818-201603)、-Re(批号:110754-201626)、-Rg1(批号:110703-201731)、-Rg2(批号:111779-200801)、-Rg3(批号:110804-201504)、-Rh2(批号:111748-200501)、原人参二醇(PPD)(批号:111747-201602)、原人参三醇(PPT)(批号:111755-200601)对照品(中国食品药品检定研究院)。人参皂苷Rc 为本实验室自制,采用高效液相色谱(HPLC)法检测其纯度>99%。
2 仪器与试剂
2.1 仪器
1525 型高效液相色谱仪、2998 二极管阵列检测器(Waters 公司);721 型紫外-分光光度计(上海光学仪器有限公司);98-1-B 型变温电热套(天津市泰斯特仪器厂);R201D 恒温水浴锅(上海豫康科教仪器设备有限公司);旋转蒸发器(上海豫康科教仪器设备有限公司);FA1104N 型万分之一电子分析天平(上海菁华科技仪器有限公司)。
2.2 试剂及溶液配制
1%香草醛高氯酸溶液:精密称定香草醛0.1 g,加入高氯酸溶解并定容至10 mL,即得(现用现配)。
77%硫酸溶液:取98%硫酸78 mL 缓缓注入适量蒸馏水中,冷却至室温,加水稀释至100 mL,混匀备用。
3 方法与结果
3.1 紫外-可见分光光度法测定总皂苷含量[8]
3.1.1 对照品溶液的制备 精密称取人参皂苷Re 对照品适量,加甲醇制成1 mg/mL 的人参皂苷Re 溶液。
3.1.2 供试品溶液的制备[1,8]取林下山参根、茎、籽和叶制成粉末(过65 目筛),分别精密称定250 mg,分别通过石油醚回流提取3 次,舍弃提取液;剩余残渣分别加10 倍量水,煎煮2 次(第1 次2 h,第2 次1.5 h),煎液滤过,合并滤液,过D101 型大孔吸附树脂柱(内径为1 cm,柱高为10 cm),水洗脱至无色后,继而以60%乙醇进行洗脱至无皂苷反应,洗脱液浓缩至干,其中,根、茎和籽样品残渣分别用甲醇溶解并定容至10mL,叶样品残渣用甲醇溶解并定容至50 mL,即得。
3.1.3 测定波长的选择及显色反应 吸取对照品溶液及供试品溶液适量,低温挥去甲醇,加入1%香草醛高氯酸溶液0.5 mL,置60 ℃恒温水浴上充分混匀后加热15 min,立即用冰水冷却2 min,加入77%硫酸溶液5 mL,摇匀。于400~800 nm 进行全波长扫描。
结果显示,对照品及供试品溶液的吸收光谱图基本相同,且最大吸收波长均为543 nm。见图1。
图1 人参皂苷Re 对照品及人参根总皂苷供试品溶液的吸收光谱曲线图Fig.1 Absorption curves of ginsenoside Re and total ginsenosides
3.1.4 标准曲线的绘制 精密吸取人参皂苷Re 对照品溶液20µL、40µL、80µL、120µL、160µL、200µL,按“3.1.3”项下方法测定,于543 nm 测定吸光度。以吸光度(A)为纵坐标、人参皂苷Re 的量(µg)为横坐标绘制标准曲线,得回归方程Y=3.8508X 0.0134,r=0.9991。
电力通信网是保证电力系统安全、稳定、经济运行的专网。在电力通信网中传送的业务有远动通道、数据采集通道、监视控制通道、继电保护通道等等业务。[1]其中继电保护的信号具有允许传输时间短、通道发送几率低、发送时间不确定等特点,因此对保护通道的传输性能有严格要求。继电保护通道一旦出现异常,必须在尽可能短的时间内修复,以保障电网运行的稳定。本文将分析电力通信中继电保护通道的两种方式,并为两种方式的继保通道深入探讨故障定位的流程和技巧,为快速处理继保通道故障奠定坚实的基础。
3.1.5 精密度试验 精密吸取林下山参根供试品溶液(批号:20171010)80L,按“3.1.3”项下方法连续测定6 次,记录吸光度值,计算各吸光度的相对标准偏差(Relative standard deviation,RSD)。得RSD 值为1.57%,表明仪器的精密度良好。
3.1.6 重复性试验 取林下山参根(批号:20171010),精密称定,按照“3.1.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液,分别精密吸取80L,按“3.1.3”项下方法测定其吸光度,计算各部位总皂苷含量。总皂苷含量的RSD值为1.46%,表明该方法重复性良好。
3.1.7 稳定性试验 取林下山参根(批号:20171010),精密称定,按照“3.1.2”方法制备供试品溶液,室温放置,精密吸取20L,按“3.1.3”项下方法分别在0 min、15 min、30 min、60 min 和120 min 测定吸光度得吸光度RSD值为1.17%,表明供试品溶液在室温下120 min内稳定。
3.1.8 加样回收率 称取已知含量的林下山参根(批号:20171010)约125 mg,共6 份,加入人参皂苷Re对照品约5 mg,按照“3.1.2”项下方法制备供试品溶液,分别精密吸取80L,按“3.1.3”项下方法测定,分别计算回收率及RSD。得回收率分别为103.8%、98.6%、97.6%、103.4%、99.1%和106.7%,RSD 值为2.87%。表明回收率良好。
3.1.9 样品的测定 取3 个批次的林下山参各部分进行混合(1∶1∶1),即得混合后样品。按“3.1.2”项下方法制备供试品溶液。精密吸取供试品混合溶液80L,按“3.1.3”项下方法测定吸收度,平行测定3份样品,结果乘以0.84,计算其总皂苷含量[5]。结果可见,林下山参叶中总皂苷含量远高于其它部位中的总皂苷含量。见表1。
表1 样品含量测定结果Tab.1 Determination results of samples (n=3,±s)
表1 样品含量测定结果Tab.1 Determination results of samples (n=3,±s)
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3.2 HPLC-UV 法测定12种单体皂苷(元)含量
3.2.1 色谱条件 色谱柱:UnitaryC1(84.6 mm×250 mm,5m);检测波长:203 nm;流动相:乙腈(A)-0.05%磷酸溶液(B);梯度洗脱:0~35 min20%~23%A,35~55min 23%~28% A,55~80 min 28%~30% A,80~100 min 30%~35%A,100~140 min 35%~100%A;柱温:30 ℃;流速:1.3 mL/min。
3.2.2 对照品溶液的制备 精密称取人参皂苷(元)Rg1、-Re、-Rg2、-Rb1、-Rc、-Rb2、-Rb3、-Rd、-Rg3、-PPT、-Rh2和-PPD对照品适量,加甲醇溶解并制成混合对照品溶液,各对照品的浓度依次为0.240 mg/mL、0.360 mg/mL、0.260 mg/mL、0.280 mg/mL、0.320 mg/mL、0.120 mg/mL、0.140 mg/mL、0.360 mg/mL、0.024 mg/mL、0.030 mg/mL、0.010 mg/mL、0.015 mg/mL。
3.2.3 供试品溶液的制备 取“3.1.2”项下制备的供试品溶液,即得。
表2 各人参皂苷(元)的线性回归方程和范围Tab.2 Linear regression equations and range for ginsenosides and aglycones
3.2.5 精密度试验 精密吸取批号为20171010 林下山参根供试品溶液20L,在“3.2.1”项下色谱条件下连续进样6 次,记录各人参皂苷(元)的峰面积,计算各峰面积的RSD(n=6),人参皂苷(元)Rg1、-Re、Rg2、-Rb1、-Rc、-Rb2、-Rb3、-Rd、-Rg3、-PPT、-Rh2 和-PPD 的RSD 分别为1.21%、1.35%、1.05%、1.78%、1.14%、1.45%、1.27%、1.39%、1.07%、1.31%、1.57%和1.31%,表明整个检测系统的精密度良好。
3.2.6 重复性试验 取批号为20171010 的林下山参根样品,精密称定,按照“3.1.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液,在“3.2.1”项下色谱条件下进样20L,记录色谱图,外标法计算各皂苷(元)含量及其RSD值,人参皂苷(元)Rg1、-Re、Rg2、-Rb1、-Rc、-Rb2、-Rb3、-Rd、-Rg3、-PPT、-Rh2 和-PPD 的RSD 分别为1.27%、1.77%、1.93%、1.74%、1.66%、1.57%、1.73%、1.81%、1.34%、1.45%、1.57%%和1.45%,表明该方法重复性良好。
3.2.7 稳定性试验 取批号为20171010 的林下山参根样品,精密称定,按照“3.1.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液,室温放置,分别在0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h 时进样测定,人参皂苷(元)Rg1、-Re、Rg2、-Rb1、-Rc、-Rb2、-Rb3、-Rd、-Rg3、-PPT、-Rh2 和-PPD 的峰面积RSD 值分别为1.67%、1.24%、1.33%、1.04%、1.11%、1.34%、1.21%、1.74%、1.27%、1.08%、1.33%和1.40%,表明该方法重复性良好。
3.2.8 加样回收率 称取已知含量的林下山参根(批号:20171010)约125mg,共6 份,加入适量各人参皂苷(元)对照品,按照“3.1.2”项下方法制备供试品溶液,在上述色谱条件下进样测定,计算各回收率及RSD 值,结果见表3。
表3 加样回收率结果Tab.3 Spike recovery test of monomer reference ginsenosides and aglycones (n=6)
3.2.9 含量测定结果 按“3.1.2”项下的方法制备供试品溶液,在“3.2.1”项下色谱条件下分别进样20L,通过外标法计算出林下山参不同部位12 种单体皂苷(元)的含量,结果见表4。
表4 林下山参中不同部位的12 种单体皂苷(元)含量Tab.4 Contents of 12 monomer ginsenosides in differents parts of MCG% (±s,n=3)(%)
表4 林下山参中不同部位的12 种单体皂苷(元)含量Tab.4 Contents of 12 monomer ginsenosides in differents parts of MCG% (±s,n=3)(%)
注:-.表示未检出 Note:-.means can not be detected
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图2.林下山参根、茎、叶、籽及对照品的HPLC 色谱图Fig.2.The HPLC chromatograms of root,stem,leaf,seed of MCG and stardands
4 结论
通过香草醛-高氯酸比色结合紫外-可见分光光度法测定了3 产地林下山参混合样品不同部位中的人参总皂苷含量。结果显示,林下山参叶中总皂苷含量最高(21.4%),其次为茎(5.1%)、根(4.4%)和籽(3.9%)。
利用HPLC-UV 法对单体皂苷(元)进行了测定,结果显示,4 个部位中12 种单体人参皂苷(元)的含量差异较大: Rb1、-Rg1、-RC、-Re 和-Rd 根中含量较多(0.460%、0.357%、0.297%、0.206%和0.153%),占总皂苷的33.4%;Re、-Rd、-PPT 和-Rb3(0.210%、0.190%、0.174%和0.160%)茎中含量较多,占总皂苷的14.4%;人参皂苷(元)Re、-Rd、-Rg1、-Rb3、-Rc、-Rb2 和-PPT(1.558%、1.489%、0.708%、0.431%、0.339%、0.325%和0.204%)叶中含量较多,占总皂苷的23.6%;籽中Re、-Rg1 和-Rd(0.677、0.349 和0.282%)含量较多,占总皂苷的33.5%。以上各结果可为林下山参各部位的质量评价提供参考依据,同时也为茎、叶等地上部分的进一步开发与利用提供了科学依据。