三种修复剂对稻米甲基汞富集的影响研究

赵家印，王永杰，钟 寰*

（1.污染控制与资源化研究国家重点实验室，南京大学环境学院，南京210023；2.华东师范大学地理科学学院，上海200241）

近年来，稻田土壤汞（Hg）污染越来越受到人们的关注[1-2]。其重要原因是：（1）稻米极易富集甲基汞（MeHg）[2]；（2）全球40%以上人口以稻米作为主食，尤其在东亚及东南亚地区。根据原环境保护部和国土资源部调查显示，中国土壤Hg 污染点位超标率达1.6%[3]。由于土壤资源紧缺，很多Hg 污染地区（如汞矿区）仍然进行水稻栽种，导致Hg污染区居民因摄食稻米而MeHg 暴露风险大幅增加[4]，由此造成了局部地区较为严重的稻米食品安全问题。另外，即使在非汞矿区，中轻度Hg 污染稻田也可能在一定程度上导致稻米总Hg 含量超过国家食品安全标准（20 μg·kg-1）。此外，大量研究表明稻米中Hg 绝大部分以MeHg 形态存在[2，5]。因此，降低稻米MeHg 累积对于减轻稻米MeHg人体暴露风险具有十分重要的意义。

目前，应用于土壤Hg 污染修复的方法主要包括物理法、物理化学法以及植物修复法等[6]，但对稻田土壤Hg 污染修复仍缺乏有效可行的修复技术，而且已有的修复方法研究大多缺少实际田间试验应用。如已有的盆栽及田间试验表明，土壤中施加一定的硒肥可以显著降低土壤中MeHg 浓度，从而降低稻米MeHg 富集[7-9]。另有研究表明，施用有机肥可对重金属的生物可利用性及其在植物体内的累积产生重要影响[10]；甲壳素因其本身含有大量羟基、氨基及乙酰氨基等基团可与重金属络合而被广泛用于修复重金属污染水体[11]。但是应用有机肥和甲壳素于土壤汞污染修复的研究鲜有报道。

本研究以南京市某地Hg 污染稻田为研究对象，研究对比在实际大田环境中3 种低成本修复剂硒肥、秸秆堆肥和甲壳素对土壤MeHg 和稻米MeHg 累积的影响及其可能的作用机理，以期为降低稻田Hg 风险和保证稻米食品安全提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验田及修复材料

修复试验田位于江苏省南京市某地，该地土壤总Hg 及MeHg 浓度分别为（877±117）μg·kg-1及（1.8±0.3）μg·kg-1，是由人为污染导致的中轻度Hg 污染土壤。该地区农业种植情况为一年两季，稻麦轮作，土壤有机碳含量为（3.9±0.5）%，pH为5.7±0.3。

试验用硒肥（亚硒酸钠）购于河南博特尔化工产品有限公司，甲壳素购于上海生物科技发展有限公司。小麦堆肥秸秆为收集田间小麦秸秆处理所得。具体方法：将收集后的小麦秸秆用去离子水清洗干净，风干粉碎（1～2 cm），然后将其放于黑色塑料容器中，加水密封，避光置于恒温培养箱中（14 d，30 ℃）烘干备用。水稻品种为南粳46。

1.2 试验过程

试验共设置4 个处理组，每组3 个平行。处理组分别为：对照（不加修复剂）组和硒肥、秸秆堆肥、甲壳素添加组。在试验田将PVC 板插入土中深约20 cm，分隔出12个相互独立的1 m2小区，编号1～12，每个小区间隔3 m，以避免小区之间可能的交叉污染。此外，土壤上覆水中的总Hg 及MeHg 浓度极低（分别小于0.05 μg·L-1及0.05 ng·L-1），因此，灌排水对土壤总Hg及MeHg的影响极小，可忽略不计。充分考虑实际生产活动，硒肥的施用量为1 g·m-2亚硒酸钠，以硒计为1.5 mg·kg-1[12]，成本约为6960 元·hm-2。堆肥秸秆和甲壳素的施用量均为1 kg·m-2，施肥约为0.20%（质量比）[13]，修复成本分别约为1500 元·hm-2及15 000元·hm-2。计算肥土比均按20 cm深度土层计算，土壤密度假设为2.2 g·cm-3。施加方法：将亚硒酸钠溶于一定体积的水中，均匀喷洒在试验区（硒肥），堆肥秸秆和甲壳素均匀撒在试验区。施加修复剂后，对土壤耕作层（0～20 cm）进行翻耕，淹水平衡7 d后，插秧。

水稻生长周期内，土壤均处于淹水状态，其他田间管理参照当地农民的种植习惯。分别在0 d（插秧当日）、10 d（分蘖拔节期）、40 d（分蘖拔节期）、80 d（抽穗扬花期）、100 d（灌浆成熟期）和130 d（成熟期），采集土壤表层5～15 cm 处土样，样品采集后立即置于50 mL 聚丙烯离心管中，密封保存，并置于冰袋中转移至实验室。在实验室中，将离心管转移到厌氧包中（厌氧包充满氮气），分别取出适量的样品于15 mL 离心管中，用于分析土壤MeHg 浓度和土壤MeHg的萃取效率（植物可利用性）[14]。在厌氧条件下处理样品，以尽量接近实际稻田土壤厌氧条件，并避免氧化对MeHg 萃取效率影响[14]，在水稻成熟期，每个小区随机收集3 株水稻的稻米和秸秆（茎和叶）样品，用去离子水清洗干净，烘干（40 ℃），称质量测定水稻地上部生物量。最后样品粉碎、过筛（100 目）用于测定MeHg浓度。

1.3 分析方法

采用美国Brooks Rand MERX 全自动甲基汞分析仪测定土壤及植物样品中MeHg。参照美国环境保护署方法1630（USEPA method 1630），该方法已广泛应用于土壤及植物中MeHg 浓度的测定[15-16]，方法检出限为0.002 μg·kg-1。具体如下：取适量样品于15 mL离心管中，加入2 mL 氢氧化钾-甲醇溶液（25%，质量比），超声15 min，涡旋混匀后放于恒温振荡箱中消解约4.5 h（250 r·min-1，60 ℃），冷却定容后，离心（20 min，4000 r·min-1，25 ℃）过滤上清液。滤液经乙基化反应后上机测试。

MeHg 萃取方法：参考已有研究报道方法[14]，使用硫代硫酸铵[（NH4）2S2O3]萃取法萃取土壤中的MeHg，具体为：将约1 g 新鲜土壤和2.5 mL 的硫代硫酸铵溶液（2 g·L-1）混匀于15 mL 离心管中，置于恒温振荡器振荡大于12 h（280 r·min-1，25 ℃），离心，过滤（0.45 μm）后取上清液。上清液及萃取后残态土壤使用上述氢氧化钾-甲醇溶液消解后，上机测试。同时，测定土壤有机质等参数[16]。

1.4 质量控制与统计分析

采用沉积物标准物质（ERM-CC580）为质控样品，与样品采用相同消解方法，回收率为83%～109%。土壤MeHg 萃取方法使用加标回收的方式质控，加标回收率为88%～110%。硫代硫酸铵萃取MeHg与残态MeHg 加和值与直接测定的土壤MeHg 浓度比值为85%～97%。

试验结果差异比较均采用单因素方差分析（One-way ANOVA，SPSS16.0）进行统计学检验。

2 结果与讨论

2.1 不同修复剂对水稻地上部MeHg累积的影响

收获期，对照、硒肥、秸秆堆肥及甲壳素处理组稻米总Hg 浓度分别为（21.1±1.2）、（10.4±0.8）、（8.3±1.2）μg·kg-1和（21.3±1.5）μg·kg-1。对照组及甲壳素处理组Hg 浓度均超过国家食品安全标准（20 μg·kg-1）[17]。就MeHg 含量而言，如图1 所示，修复剂对稻米及秸秆（地上部）MeHg 浓度的影响存在显著差异。相对于对照组，硒肥和秸秆堆肥组均显著降低了稻米和秸秆中MeHg 浓度（P＜0.05），但两者没有显著差异。硒肥和秸秆堆肥组，稻米MeHg 浓度分别降低35%和52%，秸秆MeHg 浓度分别降低46%和57%。甲壳素组水稻地上部MeHg 浓度与对照组相比，没有显著差异，表明甲壳素对水稻MeHg 累积的影响可能是微弱的。

图1 水稻地上部各组织（稻米和秸秆）中MeHg浓度Figure 1 Concentrations of MeHg in rice gain and straw

表1表明：与对照相比，3种修复剂中秸秆堆肥显著提高了稻米、秸秆及总地上部生物量（分别增加了45%、28%和38%，P＜0.05），而硒肥和甲壳素施用仅略微增加了水稻地上部生物量。就水稻地上部MeHg累积量而言，各处理组与对照组相比没有显著降低，这表明了秸秆堆肥组中“生物量稀释效应”[13]可能是导致水稻地上部MeHg 浓度降低的原因之一。秸秆堆肥作为一种有机肥，可改善土壤理化性质及提高土壤肥力，促进作物生长[18]，最终导致稻米和秸秆中Me-Hg浓度降低。

2.2 不同修复剂对土壤MeHg及其植物可利用性的影响

3 种修复剂对土壤MeHg 浓度的影响同样存在显著差异。如图2A 所示，水稻生长期间所有处理组土壤MeHg 变化范围为0.38～2.3 μg·kg-1。在水稻生长前期（10～80 d），硒肥组土壤MeHg 浓度显著降低55%～69%（P＜0.05）。在40～100 d，秸秆堆肥组土壤MeHg 浓度显著降低（45%～64%，P＜0.05）。甲壳素施用对土壤MeHg 浓度没有显著影响。土壤中MeHg 的硫代硫酸铵萃取效率可以表征土壤中MeHg 的植物可利用性[14]。如图2B 所示，在10 d 和100 d，秸秆堆肥组的硫代硫酸铵萃取效率显著降低（P＜0.05），表明秸秆堆肥可能会降低MeHg 的植物可利用性，进而降低水稻各组织中MeHg 累积。与对照组相比，硒肥和甲壳素组中MeHg 的硫代硫酸铵萃取效率没有显著变化。上述结果表明，硒肥和秸秆堆肥在影响水稻MeHg累积方面既有相同也有不同，即：秸秆堆肥既降低土壤MeHg 生成，也降低MeHg 植物可利用性，而硒肥只影响土壤MeHg 生成，不影响MeHg 植物可利用性。土壤中MeHg 含量及其植物可利用性变化决定着稻米中MeHg累积变化。

2.3 不同修复剂降低稻米MeHg累积的可能机理

土壤-水稻体系中“汞-硒拮抗”作用为使用硒降低稻米MeHg提供了科学理论依据[19]。如野外调查研究表明，在万山汞矿区，随土壤中硒含量增加稻米中无机汞和MeHg 含量不断降低[19]；Wang 等[20]的盆栽试验表明，施加不同剂量的硒（3.0～6.0 mg·kg-1），稻米中MeHg的浓度降低最大可达72%。本试验的研究结果进一步证实了土壤施硒可以有效降低稻米中MeHg含量（图1）。其主要原因可能是硒导致土壤中无机汞的生物可利用性降低，进而降低土壤MeHg 的生成。在水稻生长期，土壤中高价态的硒（Se6+或Se4+）在还原条件下转化为低价态硒（Se0或Se2-），并与无机汞结合生成惰性硒化汞[20]，进而降低土壤MeHg 的生成（图2A），但是硒的转化并没有改变土壤中MeHg的植物可利用性（图2B）。

多项研究表明，土壤中有机质对Hg 的行为有着十分重要的调控作用。如秸秆直接还田可增加稻米中MeHg 含量[16]，这可能是秸秆腐解产生大量活性有机质可促进土壤中汞的甲基化作用所致；有研究表明，有机质降解转化所形成的腐殖质通常会抑制汞的甲基化[21-22]。本试验中，一方面秸秆堆肥中含有的大量腐植酸等大分子有机质[23]可能与无机汞络合，从而固定土壤无机汞，降低MeHg的生成[21]。另一方面，在水稻生长期，土壤中硫酸盐还原可能与秸秆堆肥中的腐植酸相互作用生成新还原性有机硫官能团，如巯基等[23-25]，这些还原性有机硫可能显著降低了土壤中MeHg 的植物可利用性。因此，秸秆堆肥降低水稻组织中MeHg 浓度可能是缘于腐植酸既抑制了土壤MeHg生成，又降低了MeHg的植物可利用性。

此外，生物累积因子（BAF，计算方法：130 d 时水稻组织中MeHg 浓度/130 d 时土壤MeHg 浓度）结果（图3A）显示，在硒肥组稻米及秸秆中MeHg的生物累积因子显著低于对照组，这表明了在硒肥施用条件下土壤中MeHg 难以转运到水稻秸秆及稻米中。Zhang等[19]研究结果表明，水稻根部形成的硒化汞可能是降低MeHg 或无机汞转运的主要原因之一。Wang等[20]盆栽试验结果表明，土壤施硒肥对MeHg 在水稻各组织中的分配有一定的影响，如土壤施硒略微增加MeHg 在水稻根部的分配比例。因此，硒肥施用条件下BAF 的降低可能是水稻根部“汞-硒拮抗”作用的结果。但是，稻米和秸秆MeHg 浓度与土壤中硫代硫酸铵萃取浓度的相关性（图3B）表明，土壤中MeHg含量及植物可利用性很大程度决定了稻米MeHg 浓度。

3 结论

图3 水稻地上部各组织（稻米及秸秆）中MeHg的生物累积因子（A）及其MeHg浓度与土壤平均可萃取MeHg浓度（10～130 d）的线性关系（B）Figure 3 The MeHg bioaccumulation factors（BAFs）of rice grain and straw（A）and the relationship（B）between MeHg levels in rice aboveground tissues and the time-averaged MeHg concentrations extracted by（NH4）2S2O3 in soil（days 10～130）

（1）施用一定量的硒肥及秸秆堆肥可显著降低稻米中MeHg 的累积，而施用甲壳素对水稻中MeHg 累积没有显著影响。因此，稻田汞污染修复中可考虑硒肥和秸秆堆肥及两者的联合施用技术，并进一步检验这两种修复剂的长期有效性。

（2）施加硒肥和秸秆堆肥降低稻米中MeHg 累积的主要原因有：一方面，硒和秸秆腐殖质降低土壤中无机汞活性，进而降低MeHg 浓度，最终导致稻米MeHg累积降低。另一方面，秸秆腐殖质降低土壤中MeHg植物可利用性及水稻根部发生“汞-硒拮抗”作用可能在降低稻米中MeHg的累积方面起到一定作用。