全自动生化分析仪检测尿17-酮类固醇的性能评价

2019-03-07刘辰庚张丽春赵萍萍王红彦王培昌

中国医学装备 2019年2期

程勇刘辰庚张丽春赵萍萍王红彦王培昌*

尿中17-酮类固醇(17-ketosteroide，17-KS)是肾上腺皮质与睾丸及卵巢某些类固醇激素代谢产物，可反应肾上腺皮质激素、糖皮质激素及性腺分泌总的情况，对于评价肾上腺分泌雄激素的功能具有一定的价值。多年来，17-KS的临床检测方法主要为分离柱色谱法，但操作步骤繁琐、费时且费力，不适合大批量的快速检测，不能满足检验专业快速及准确的要求[1]。

2017年，原国家食品药品监督管理局(State Food and Drug Administration，SFDA)首次批准了用于生化分析仪的17-KS检测方法及试剂盒，基于此，本研究分析评价该方法的检测性能及其与传统手工方法检测结果的一致性及临床应用。

1 材料与方法

1.1 临床资料

选取2017年5-9月首都医科大学宣武医院收治的50例高血压患者将其纳入高血压组，其中男性25例，女性25例，平均年龄60岁；选取30例嗜铬细胞瘤患者将其纳入嗜铬细胞瘤组，其中男性15例，女性15例，平均年龄59岁；选取30例库欣综合症患者将其纳入库欣综合征组，其中男性15例，女性15例，平均年龄59岁；另随机抽取30名健康受试者作为健康对照组，其中男性15名，女性15名，平均年龄60岁；随机选取30名高血压待确诊患者作为待确诊组，其中男性15名，女性15名，平均年龄38岁。本研究内容已经医院伦理委员会审核批准。

1.2 纳入与排除标准

(1)纳入标准：①高血压患者满足《中国高血压防治指南》的诊断标准；②嗜铬细胞瘤患者满足《肾上腺嗜铬细胞瘤的诊断与治疗指南》的诊断标准；③库欣综合征患者满足《库欣综合征治疗的临床实践指南》的诊断标准；④健康对照组生长发育正常，心脏、肝脏、肾脏和脑不存在其他疾病，未服用其他神经、精神类药物及其他治疗性药物；⑤待确诊患者为有高血压症状，但排除嗜铬细胞瘤和库欣综合征者。

(2)排除标准：①心脏、肝脏、肾脏和脑存在其他疾病；②服用其他治疗性药物者。

1.3 仪器与材料

(1)仪器设备。7600全自动生化分析仪(日本日立公司)，该试剂盒为液体双试剂，按照试剂盒说明书在日立7600仪器P模块设置反应条件并操作；722 s型紫外可见分光光度计(上海析谱仪器有限公司)，检测时仪器处于正常的维护、保养和检定状态。

(2)试剂盒材料。分离柱色谱法尿17-KS检测试剂盒(西班牙Bio-System公司)；均相酶免疫法尿17-KS检测试剂盒(苏州博源医疗科技有限公司)。

1.4 检测方法

(1)样本采集与处理。5组受试者按照《全国临床检验规程第四版》的要求准确留取24 h尿液，经5 L带刻度烧杯精确测量尿量，混合均匀用带帽10 ml离心管留取8 ml尿液，于离心机上3000 g离心5 min，上清置于新的带帽离心管2～8 ℃保存，3 d内检测完毕。

(2)手工法。采用分离柱色谱法，试剂盒批号：REF11002、LOT17953，校准品LOT127XA，校准品稀释液LOT126XA，质控品LOT142XA，质控品稀释液LOT142XA。由具有中级专业职称且长期从事17-KS检测工作的人员按试剂说明书进行实验。

(3)生化法。均相酶免疫法尿17-KS检测试剂盒，试剂盒批号：Lot#170327，校准品Lot#170327，质控品Lot#170327。

1.5 观察及评价指标

(1)正确度验证。①分别使用两种方法检测第三方定值质控品(BIO-RAD LOT63360)3次，计算平均值与相对偏差；②分别使用两种方法学试剂检测两种试剂盒的配套校准品(选3个浓度)3次，计算平均值与相对偏差。

(2)精密度验证。①批内精密度，选取2个尿液样本连续检测20次，计算批内精密度(CV%)；②批间精密度，选取2个尿液标本上午测2次，下午测2次，连续检测5 d。

(3)线性范围。①手工法，将尿液标本加入标准物质至试剂盒标示的线性范围上限，做比例稀释，将理论值和实测值进行线性回归，计算相关系数；②生化法，用尿液标本将试剂盒中高浓度17-KS质控至试剂盒标示的线性范围上限，做比例稀释，将理论值和实测值进行线性回归，计算相关系数。同时，利用本组数据使用线性回归计算两种方法的相关性，使用t检验明确其有无统计学差异。

(4)干扰试验。①分别使用胆红素、血红素、甘油三酯、血红蛋白、白蛋白和抗坏血酸进行抗干扰试验，在质控品中加入一定量的干扰物质达到相应浓度；②计算检测试剂浓度与理论浓度的偏倚(%)。因Bio-System试剂盒未给出抗干扰的指标范围，故使用博源公司试剂盒给出的抗干扰指标进行试验。

(5)受试者阳性率。使用以上两种试剂盒检测疾病和健康受试者的17-KS，统计其检测结果的一致性和阴阳性率等诊断性能指标。

1.6 统计学方法

使用SPSS 18.0统计软件对数据进行统计分析。组间数据使用两样本t检验进行组间检测结果的统计学分析；同一受试者不同检验方法的数据比较使用配对t检验；率的比较使用x2检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种检测方法正确度验证结果

使用手工法和生化法检测BIO-RAD的相对偏差分别为8.43%和4.23%，手工法高于生化法。两种方法检测各自配套校准品的偏差均相对较小，检测非配套校准品的偏差相对较大，但偏差均＜15%，见表1。

表1 两种检测方法正确度相对偏差验证结果(%)

表2 两种检测方法干扰试验结果(%)

表3 两种检测方法临床验证结果(%)

2.2 两种检测方法精密度验证结果

手工法的批内精密度为7.44%，生化法的批内精密度为3.99%；手工法的批间精密度为13.18%，生化法的批内精密度为5.22%；生化法优于手工法。

2.3 两种检测方法线性范围和相关性验证结果

手工法线性范围(0～120 mg/L)达到说明书要求，相关系数r=0.967，P＜0.05；生化法线性范围(0～120 mg/L)达到说明书要求，相关系数r=0.999，P＜0.05，生化法线性范围相关系数优于手工法。两种方法的检测结果相比，差异无统计学意义(r=0.92，P＞0.05)，具有良好的相关性。

2.4 两种检测方法干扰实验结果

干扰实验生化法试剂盒在其试剂盒说明书给定的范围内其检测性能指标良好，在胆红素≤40 mg/dl、血红素≤500 mg/dl、甘油三酯≤1000 mg/dl、血红蛋白≤1000 mg/dl、白蛋白≤1000 mg/dl和抗坏血酸≤10 mmol/L的情况下偏倚≤10%，手工法试剂盒其抗干扰性能低于生化法，见表2。

2.5 两种检测方法临床验证结果

两种检测方法对5组进行临床验证，生化法检测嗜铬细胞瘤阳性率高于手工法，其差异有统计学意义(x2=4.59，P＜0.05)，参考临床诊断得知生化法准确率高于手工法；两种方法检测高血压肾上腺肿瘤、待确诊患者和健康对照组阳性率和阴性率一致，见表3。

3 讨论

肾上腺皮质球状带分泌过多盐皮质激素和糖皮质激素，还可分泌过多的性激素(睾酮)，17-KS为睾酮的代谢产物，增高提示肾上腺肿瘤时激素及其代谢产物的改变[2]。分泌过多的皮质醇，引起库欣氏综合征。过多的睾酮和皮质醇引起17-KS的大副增高[3]。17-KS的检测也可用于肾上腺肿瘤术后的疗效观察，术后1个月所有患者血清皮质醇、醛固酮、17-OH、17-KS、VMA以及血清儿茶酚胺均正常[4]。故而检测17-KS，对于上述病病的诊断与治疗有一定的参考意义。

由于17-KS属于小分子代谢物，使用传统的生化和免疫方法难以对其进行有效的检测，故长期以来，大部分实验室均使用抽提法或分离柱色谱法进行手工检测。但随着国家对试剂耗材注册证制度的不断严格，使临床实验室对17-KS的检测试剂盒的选择仅能在有限的几种进口品牌中选择，但均为手工方法。

随着医疗技术的不断发展，对于疾病的诊断、治疗及监测提出越来越高的要求，临床检验的领域也有了飞速的进步，方法学不断推陈出新。以往不可能完成的检测现在都在不断被实现。临床医生对肾上腺相关疾病的病因及治疗可以有多种辅助方法确证，而尿液17-KS作为辅助诊断依据的一种，导致临床实验室的相关标本量不断扩大，这对于17-KS一类仅能进行手工法检测项目的检测压力不断增加，许多实验室出现了须有专人从事17-KS等项目手工检测的情况，不符合临床实验室定量检测项目自动化、标准化和精密化的发展趋势[5]。肾上腺皮质疾病的诊断和治疗中，生化检验作为近几年肾上腺皮质疾病诊断中的一种新技术，在临床上应用的越来越广泛，发挥的作用也愈发明显[6]。在此背景下，可在生化仪检测17-KS的试剂盒应运而生。

经本研究实验室的方法学评价，生化法的17-KS检测试剂盒其正确度、精密度均优于手工法，且其正确度和精密度的实测值已经达到了常规化学中其他小分子项目如肌酐、尿素等的国标要求，表明其检测精度能满足临床的诊治需求，并对个体内变异进行有效区分。尿液的颜色多变，以色谱法为基础的手工法17-KS检测较易受色素的影响；但以均相免疫法为基础的生化法检测则对尿液的颜色抗干扰能力较强[7]。

本研究实验表明，在模拟血尿、胆红素尿、蛋白尿和使用大量水果或维生素人群标本的抗干扰试验中，生化法的抗干扰能力优于手工法。在疾病诊断异常率方面，两者具有大体相似的性能；但在临界值处的检测结果方面，由于生化法具有更好的正确度和精密度，故其对这类患者的诊断更有优势。

色谱法虽然是检测17-KS的较好方法，但目前国内尚无经SFDA颁发注册证的色谱仪法的17-KS检测系统。在此背景下，我国试剂厂家率先研制出以均相酶免疫为方法学的17-KS检测试剂盒，该试剂盒于2017年3月15日获得SFDA的批准也使其成为了国内首个能进行17-KS自动化检测的试剂盒。均相酶免疫技术的最大技术优势是检测药物、激素、有机物等小分子物质，17-KS即为其中一种。其技术核心是将具有生物学活性的半抗原(即待测小分子)与生物酶经交联剂结合成酶标记的半抗原，同时暴露半抗原的抗原表位使其保留半抗原的抗原性，暴露酶的活性中心以保持酶的活性。当酶标记的半抗原与相应的特异性抗体结合后，由于空间位阻、蛋白质相互作用或者共价键的形成，使所标记的酶与抗体密切接触，覆盖或影响酶活性中心的结构使酶全部或部分失活。待测标本中的待测小分子也是有活性半抗原，故能与反应体系中的生物酶标记的半抗原共同争夺抗体并与之结合。由于反应体系中抗体的量是一定的，如待测样本中的待测物浓度越高，则其竞争性结合的抗体量越大，导致与生物酶标记半抗原结合的抗体量减少，生物酶活性受抑制的程度降低，故从酶活力的测定结果就可推算出标本中待测物含量[8]。

目前，临床实验室使用均相酶免疫分析技术作为方法学的检测项目相对有限，对于大部分小分子的检测，均以化学发光法、电化学发光法和微粒子酶免疫法为主。同时，上述检测项目多为在配套检测系统上进行，具有较好的溯源性、正确度和特异性。对于本研究所使用的均相酶免疫分析技术而言，由于其使用了开放系统，可在任意全自动生化仪上进行检测，故对其进行方法学确认实验，以保证检测结果的有效性和可靠性就尤为重要。同时，24 h尿液17-KS检测的生物参考区间相对其他激素类项目而言更加狭窄，故在生物参考区间边缘的样本检测的正确性和稳定性更值得关注。但由于均相酶免疫法的技术核心是抗原抗体反应，其要求的pH值环境和离子条件较色谱法严格，故在一些酸性尿、碱性尿和严重肾脏病患者的尿液中其可能出现不可预知的检测偏差，应引起实验室工作人员和临床医生的重视[9]。