食管癌患者外周血CD3+T细胞分泌细胞因子的水平变化及其临床意义

袁晓红，李 鹏，李雨微

(1.西安交通大学第二附属医院检验科，西安 710014；2.西安交通大学第一附属医院检验科，西安 710061；3.西北妇女儿童医院医学遗传中心，西安 710061)

食管癌是当前临床上常见的一种疾病，随着经济发展和生活方式改变，其发病率不断升高。报道表明，食管癌的发病群体主要为中年群体，并且男性发病率高于女性群体[1]。我国是世界上食管癌发病率较高的国家之一，大约每年有15万人死于食管癌。食管癌的临床症状主要为下咽困难，给患者日常生活带来了极大不便。因此，应探讨更有效的治疗方法，改善患者病情。研究表明，食管癌与患者外周血CD3+T细胞分泌细胞因子水平变化存在相关性，肿瘤能够对可溶性免疫抑制因子进行表达，并对患者的局部免疫起到抑制作用[3]。T细胞分泌细胞因子是较为常见的调节性因子，对患者自身反应性T细胞存在抑制作用，对免疫能力起到了提升作用[4]。本文探讨食管癌患者外周血CD3+T细胞分泌细胞因子的水平变化，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年1月至2018年1月在西安交通大学第二附属医院接受治疗的28例食管癌患者。纳入标准[5]:(1)通过对患者进行病理诊断，确诊为食管癌；并应用由美国癌症联合会(AJCC)和国际抗癌联盟(UICC)联合制定订的恶性肿瘤TNM分期标准对肿瘤进行分期， 0期和ⅠA期为早期，ⅠB～Ⅲ期为进展期，Ⅳ期为食管癌晚期；(2)患者在用药后，没有取得明显的效果。排除标准[6]:(1)不愿参与这次研究或临床数据不完善的患者；(2)排除伴有精神疾病的患者；(3)排除多源性肿瘤患者；(4)排除接受化疗治疗的患者；(5)排除自身免疫障碍患者。食管癌患者为研究组(n=28)，男14例，女14例，年龄56～75岁，平均(61.3±4.2)岁，住院时间12～20 d，平均住院时间(14.3±3.1)d，TNM分期，Ⅰ期患者2例，Ⅱ期患者15例，Ⅲ期患者11例；纳入同期本院健康体检者28例为对照组，男15例，女13例，年龄54～73岁，平均(63.4±4.1)岁。本研究已经得到患者同意，一般资料差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。经过医院伦理委员会批准。

1.2方法 首先，在手术前1 d和手术第3天,采集患者的空腹静脉血2 mL，加 5 mL洗涤剂洗涤,离心(1 200 r/min×10 min),倒去上清液,以500 μL洗涤剂悬浮细胞液。取100 μL细胞悬液,加20 μL抗细胞表面抗原的抗 CD3-FITC,涡旋混匀,室温暗处孵育20 min。然后对细胞进行打孔，加1.5 mL打孔液,离心(1 000 r/min×5 min)。倒去上清液,以100 μL打孔液悬浮细胞。对细胞因子进行染色：在一管内加8 μL抗细胞因子的单克隆抗体,并另设一管加10 μL该单克隆抗体的同型抗体。将其放置在4 ℃暗处进行孵育大约20 min。加其加入1.5 mL打孔液,对其进行离心(1 000 r/min×5 min)。采用流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司，型号：IMMAGE免疫分析仪)和荧光直接标记对患者外周血T细胞分泌细胞因子进行标记[7]。将使用荧光直接标记的18 μL单克隆抗体放置到90 μL的抗凝的外周血，并在室温下对其进行孵育大约20 min，并将其加入红细胞裂解液，进行孵育大约20 min，并对其进行洗涤[8]。最后，使用流式细胞仪对其进行相关检测，对检测数据进行相关分析[8]。

1.3观察指标 (1)比较两组外周血T淋巴细胞与正常值。使用流式细胞仪对患者抗体进行标记，并对CD3+进行检测，然后对CD4+/CD8+、CD3+/CD8+、CD3+/CD4+进行相应的计算。(2)比较两组外周血CD3+T细胞分泌因子IL-2、IL-4、IL-10、IL-12表达水平。(3)比较两组外周血CD3+T细胞分泌因子肿瘤坏死因子(TNF)-α和干扰素(IFN)-γ表达水平[9]，采集患者静脉血3 mL，将其静置，分离取得上层血清，应用酶联检测试剂盒，使用ELISA方法对TNF-α和IFN-γ细胞因子进行检测。

2 结 果

2.1两组外周血T细胞值比较 研究组CD3+/CD4+、CD4+/CD8+表达水平低于对照组，研究组CD3+/CD8+、CD3+表达水平高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 两组外周血T细胞与正常值比较

2.2两组IL-2、IL-10、IL-12表达水平比较 研究组IL-2、IL-10、IL-12表达水平低于对照组，研究组IL-4表达水平高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，具体见表2。

表2 两组外周血CD3+T细胞分泌因子表达

2.3两组TNF-α和IFN-γ表达水平比较 研究组TNF-α表达水平高于对照组，研究组IFN-γ表达水平低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，具体见表3。

表3 两组TNF-α和IFN-γ表达水平比较

3 讨 论

相关报道表明，我国是食管癌发病率较高的国家之一。因此，患者出现相应的症状时，应及时进行诊断，避免延误患者的最佳治疗时机。同时，还应加强对疾病的防治，制定合理的生活计划。引起食管癌的原因较多，主要分为化学病因、生物性病因、缺乏某些微量元素和生活习惯等[10]。当前，对于食管癌的治疗主要采取药物、手术、化疗和放疗的方法。尽管上述方法已经被广泛运用，但是目前对患者的治疗效果仍十分有限，因此，当前的首要任务是提高对患者的治疗效果，保证患者的生活质量[11]。细胞免疫是患者机体抗肿瘤免疫功能的重要组成部分，由T淋巴细胞为细胞免疫进行介质的传递，T淋巴细胞能够进行有效的分化，主要分化为细胞毒性和辅助性T淋巴细胞[12]。

而调节性T细胞对免疫细胞功能的负调控细胞存在较好的抑制作用，对患者机体的抗肿瘤免疫反应起到明显的抑制作用[13]。通过对食管癌患者外周血CD3+T细胞分泌细胞因子的水平变化及其临床意义进行探讨，Th1细胞分泌INF-r、TNF-α和IL-2细胞因子,主要介导迟发型超敏反应和细胞免疫反应，Th1细胞分泌IL-10和IL-4细胞因子,对患者体液免疫反应进行介导[14]。健康患者,Th1/Th2是一种较为平衡的状态[15]。在本次研究中，应用流式细胞术对患者T细胞因子IL-2,IL-12,IFN-r,TNF-α、IL-4和IL-10进行检测,发现研究组CD3+/CD8+、CD3+表达水平低于对照组，说明患者此细胞因子反应模式较弱。同时，研究组TNF-α表达水平高于对照组，TNF-α表达水平升高没有达到有效的抗肿瘤作用，主要原因为TNF-α仅是患者机体进行免疫反应的一个或某个环节。当患者的免疫功能受损，TNF-α的抗肿瘤效应不能有效作用。

研究结果显示，研究组CD3+/CD8+、CD3+表达水平低于对照组，研究组CD4+/CD8+、CD3+/CD4+表达水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。这一结果充分表明了，食管癌患者外周血CD3+T细胞分泌细胞因子升高，患者的免疫力出现较为明显的降低。同时研究结果说明，对患者外周血CD3+T细胞分泌细胞因子进行流式细胞技术检测，不仅特异度和灵敏度高，同时对患者细胞免疫功能进行有效体现，是患者病情进展和免疫状态的标志物。如果患者机体CD4+细胞能够合理地减少或消失，则可改变其对患者肿瘤细胞的免疫无应答性，使得患者非特异性和特异性效应细胞自然发育，对患者抗肿瘤免疫进行有效激活。研究组IL-2、IL-10、IL-12表达水平低于对照组，研究组IL-4表达水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。研究组TNF-α表达水平高于对照组，研究组IFN-γ表达水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。这一结果充分表明了，对食管癌患者外周分泌细胞因子水平进行合理的分析，能够增进对患者发病机制和免疫调节机制的了解，并为患者的治疗提供有效的治疗依据，有利于患者疾病的治疗，提高患者生活质量。对于食管癌患者，食管癌患者外周血CD3+T细胞分泌细胞因子CD4+/CD8+、CD3+/CD4+表达水平显著增高，说明患者的免疫耐受力与免疫逃逸存在较明显的关系。