细胞因子调控肌腱干细胞分化方向的研究进展

陈计稳，郑小飞，王华军

(暨南大学 第一临床医学院∥暨南大学 附属第一医院 骨关节与运动医学中心，广东 广州 510630)

肌腱损伤是危害生活质量的常见病，随着老龄化社会程度的加重和体育运动的普及其发病率不断增长[1-3].研究显示，在50至80岁以上人群中，肩袖损伤的发病率从23%逐步升高至65%[4].在芬兰跟腱损伤的发病率由1979年的每10万人群2.1人增加到2011年的每10万人群21.5人，33年间上升了9倍多[5].高发病率的肌腱损伤也给患者及社会带来了巨大的经济负担.仅肩袖损伤在美国每年造成的直接经济损失就超过70亿美元[6].虽然肌腱损伤的治疗技术逐步提高[7-8]，各种药物及修复材料不断更新，但由于肌腱损伤后再生能力较弱，存在瘢痕增生和肌腱粘连等因素，其生物力学性能往往只能达到正常肌腱的40%.因此，肌腱损伤后如何获得良好的再生及满意的功能恢复是目前亟待解决的临床难题.肌腱干细胞(tendon derived stem cells, TDSCs)具有腱系分化的潜能，自从2007年被发现以来，已有动物实验证明局部注射肌TDSCs能够显著促进肌腱损伤愈合[9].此外，TDSCs在组织工程生物支架的应用上也具有良好的前景[10].随着研究的不断深入，研究人员发现由于TDSCs具有多向分化的生物学特性，除了腱系分化外，还包括成脂分化、成软骨分化、成骨分化，而且其影响因素十分复杂，如何在体内诱导TDSCs定向分化是TDSCs发挥临床疗效的关键.细胞因子(cytokine，CK)具有调节细胞生成代谢、细胞免疫反应以及修复等生物学作用，是体内生理病理反应的重要调控因子.目前相关研究已经证明细胞因子对TDSCs的分化方向也具有重要的调节作用[11]，本文就细胞因子影响TDSCs分化方向及相关机制展开探讨.

1 转化生长因子-β(transform growth factor, TGF-β)

TGF-β是机体生长发育、损伤修复的重要调节因子.目前研究证实TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3这3种亚型都参与了TDSCs的分化过程，在肌腱形成和损伤修复中起着重要作用[12].GUO J等[13]将从大鼠跟腱分离培养获得的TDSCs在质量浓度为10 ng/mL TGF-β1条件下，培养10 d后分别检测肌腱细胞标志物Col1a1、Dcn和Fmod及主要的腱系转录因子 Scx、Egr1和Eya1，结果发现实验组以上标志物的表达显著高于对照组，表明在TGF-β1的诱导下TDSCs向肌腱细胞分化的能力明显增强.然而随着研究的不断深入，发现质量浓度不同的TGF-β1对TDSCs的分化方向产生不同的作用.Holladay[14]分别使用质量浓度为1、10、100 ng/mL TGF-β1与TDSCs共培养，结果发现1 ng/mL质量浓度组的骨粘连蛋白(osteonectin)表达上调，硫酸氨基葡萄糖染色呈阳性，证明该组TDSCs成软骨样分化.随着质量浓度的升高SCX、TEN-C、1型和2型胶原蛋白的表达上调，显示TDSCs成肌腱细胞分化.TGF-β3在TDSCs分化中的作用也与作用时间及质量浓度相关.郭宇鹏等[15]将大鼠跟腱TDSCs分别在不同质量浓度TGF-β3(5.0、2.5、1.0、0 ng/mL)的细胞培养皿中培养，分别于第1、3、5天收集细胞进行成腱、成脂、成软骨及成骨分化的基因标志物表达的检测，结果发现在短时间、低质量浓度TGF-β3培养会诱导TDSCs向腱系分化，而高质量浓度、长时间刺激则向成骨或成软骨方向分化.由此可见TGF-β3的具体作用与其质量浓度和处理时间存在着交互作用，但其具体机制还需进一步研究.TGF-β2也具有调控TDSCs腱系分化的作用.研究发现当TGF-β2受到抑制时，肌腱纤维排列松散不规则，纤维间隙明显增大，1型胶原、Thbs 4和细胞外基质生成均显著减少.当TGF-β2表达增加时，肌腱纤维排列规则、紧密，TDSCs腱系分化标志物Scx、Mkx和I、III型胶原也明显增加.进一步研究还发现miR-378 a可以作为TGF-β2的上游调控其表达[16].由此可见，TGF-β各个亚型对TDSCs分化方向的作用各不相同，并且受质量浓度的影响.在干细胞培养及诱导分化时可以根据分化方向的需要选择不同的TGF-β亚型和质量浓度，但其机制尚需进一步研究.

2 骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)

BMP属于转化生长因子家族，目前与TDSCs分化相关的BMP亚型主要有BMP-2、BMP-12.Rui[17]将大鼠TDSCs在含有BMP-2的培养基中培养，培养3 d和一周后发现实验组中与钙结节结合的茜素红含量显著高于对照组，提示BMP-2促进TDSCs成骨分化；在培养第14天时成脂分化标志物C/EBP和pPARγ的mRNA表达在实验组显著增加，表明BMP-2在两周时促进TDSCs成脂分化；而在培养第21天时，实验组HE染色显示细胞颗粒中可见肥大的软骨细胞样细胞，并且细胞中Sox9、PG以及细胞外基质中II型胶原的表达均显著增高，证实TDSCs在BMP-2培养3周时向成软骨方向分化；而在所有时间点实验组TDSCs中腱系分化标志物Col1a1、scx和tnmd的表达随培养时间的延长而降低，证明BMP-2具有抑制TDSCs腱系分化的作用.BMP-2这一调控作用也在国内学者的研究中得到证实[18].由此可见BMP-2对TDSCs的调控呈时间依赖性.与BMP-2的作用相反，BMP-12则表现出明显的促进TDSCs腱系分化的作用.XU K[19]分别将BMP-12与结缔组织生长因子(CTGF)共同转染的TDSCs、单纯BMP-12或CTGF转染的TDSCs、以及未被BMP及CTGF转染的TDSCs移植入大鼠髌腱损伤模型中，结果显示BMP-12和CTGF共转染的TDSCs组大鼠髌腱在移植术后第2周及第8周愈合显著优于其他3组，该组髌腱的生物力学及组织学结果均接近正常髌腱.同时成腱分化基因 I/III型胶原, 肌腱蛋白C(tenascin-C)和 scleraxis表达均上升，而成脂、成软骨及成骨分化基因表达的标志物明显下调，证明了BMP-12可协同CTGF促进TDSCs向腱系分化的作用.因此，BMP-12作为诱导TDSCs腱系分化的细胞因子可用于肌腱修复的研究，但其需要与CTGF等生长因子共同作用才能起到良好的腱系分化作用.

3 碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factot，bFGF)

bFGF也是调控TDSCs分化的重要因子.大量动物实验显示肌腱在损伤后，损伤处的肌腱细胞、成纤维细胞及炎症细胞中成纤维细胞生长因子的表达明显上调，加速成纤维细胞的增殖，最终促进了损伤的愈合.盛加根等[20]利用鸡制作第3指屈肌腱切断模型，A组使用纤维蛋白封闭剂(fibrin sealant，FS)处理，B组用500 ng bFGF与FS混合物0.6 μL处理，C组为对照组做单纯缝合.结果显示在术后4周及8周时bFGF与FS混合物治疗组的肌腱生物力学明显优于其他两组，病理切片显示该组肌腱及腱周胶原含量也明显增高，证明bFGF可以有效地促进肌腱损伤后的愈合.另外，Oryan[21]用bFGF治疗兔浅屈肌腱损伤也证明其在促进肌腱损伤愈合的应用价值.随着研究的不断深入，研究人员发现bFGF是通过促进TDSCs腱系分化而治疗肌腱损伤的.Tokunaga[22]在大鼠肩袖损伤模型中使用bFGF混合明胶处理肩袖损伤端，结果在第6周和第12周实验组的大鼠肩袖最大拉力显著优于对照组，TDSCs中PCNA、Scx、Tnmd、Sox9等基因表达均明显上调，这提示bFGF促进了肌腱干细胞的腱系分化.随后Vigano[23]在体外研究中将TDSCs与bFGF共同培养，发现在肌腱干细胞减少的同时，肌腱细胞的数量不断增加，该研究也证明了bFGF诱导TDSCs的腱系分化作用.因此，bFGF是诱导TDSCs键系分化的重要细胞因子，但目前研究多为局限于动物实验，其作用机制尚需进一步研究.

4 白细胞介素(interleukin, IL)

IL是体内重要的一类细胞因子，具有传递信息，激活和调节免疫细胞的作用.在介导细胞活化、增殖与分化中也起重要作用.近年来，研究发现其还可调控TDSCs分化.目前的研究主要涉及IL-1、IL-6和IL-10.Zhang[24]将小鼠跟腱损伤部位的TDSCs在不同质量浓度IL-1β(1、5、10 ng/mL)中培养，结果显示培养7 d后所有质量浓度的IL-1β组TDSCs中的胶原蛋白I/III、二聚糖、纤维调节素、早期反应发生蛋白和肌腱细胞标志物SCX、腱调蛋白的表达比对照组均显著下调，证明其对TDSCs腱系分化的抑制作用.另外还发现成脂标志物Cebpa和Cebpg，成软骨标志物Agg和SOX9，成骨标志物Osx和Runx2等均受到抑制，表明IL-1β同时抑制TDSCs成脂、成软骨及成骨分化.并且IL-1β对TDSCs分化的抑制作用是不可逆的，因为在培养基去除IL-1β后，这种抑制作用依然持续存在.另外IL-6对TDSCs的腱系分化也有抑制作用.Chen[25]将正常的大鼠跟腱TDSCs在不同质量浓度的IL-6环境下培养，结果发现IL-6促进TDSCs从细胞周期的G1期到G2/M期转变，极大的增强了TDSCs的增殖能力，然而实验组的肌腱细胞标志物(Scx、胶原蛋白I/III和腱调蛋白)的表达均被显著地抑制，证明了其腱系分化受到明显的抑制.国内学者陈思伟[26]也做了类似研究，同样证实了IL-6抑制TDSCs成腱分化，还进一步证明IL-6对TDSCs腱系分化的抑制作用是通过Jak/STAT3信号通路实现的.多项研究还探讨IL-10对TDSCs腱系分化的影响.Deng[27]将TDSCs与不同质量浓度IL-10(0.1、1、10、100 ng/mL)培养3 d，经检测发现实验组TDSCs Scx、Col1、Tnmd、Col3 mRNA的表达水平较对照组显著下降，而且IL-10高质量浓度组(10、100 ng/mL)比低质量浓度组(0.1、1 ng/mL)下降更明显.由此可见，目前研究发现的各种白细胞介素都对TDSCs的腱系分化起到抑制作用，甚至对其他方向的分化也存在抑制作用.但白细胞介素家族成员众多，其他因子的具体作用还需进一步研究.

5 结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)

CTGF是一个富含半胱氨酸的分泌肽，是对结缔组织细胞有促分裂和化学趋化活性的生长因子，还具有促细胞增殖、迁移及分化等作用，与包括血管、皮肤、心脏、肾脏、胰腺、肺及肝脏等在内的许多组织器官纤维化发生发展密切相关.近年来研究进一步发现其在TDSCs分化过程中也起到一定的调控作用.Lui等[28]在大鼠髌腱损伤模型中分别采用经CTGF处理过的TDSCs、未处理的TDSCs移植于髌腱损伤处，并与对照组进行对比研究，8周后通过组织学、超声影像学、以及生物力学测定对比发现，采用TDSCs移植的两组肌腱纤维排列及肌腱横截面积甚至优于未移植TDSCs的对照组16周时的愈合程度，而经过CTGF处理的肌腱愈合情况显著优于未经CTGF处理组，从而证明CTGF能够促进损伤肌腱的愈合.随后，窦海波等[29]进一步研究发现大鼠跟腱TDSCs经CTGF培养14 d后，I型胶原和腱生蛋白C(Tenascin-C)等成纤维细胞蛋白标志物的mRNA和蛋白的含量均比对照组显著升高，这就证明在CTGF的诱导下，TDSCs有效地向肌腱成腱性分化.Liu等[30]的研究也证明CTGF可以调控TDSCs腱系分化，进而促进肌腱愈合的作用，还进一步证明CTGF是通过Smad 1/5/8信号通路促进TDSCs成腱分化的作用机制.目前，关于CTGF调控TDSCs分化的研究较少，还需进一步的深入研究.

6 其他细胞因子

胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factors, IGF-1)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)、早期生长反应因子(early growth response factor, EGR-1)、前列腺素E2(prostaglandin, PGE2)、P物质(P substance, SP)等其他细胞因子也具有调控TDSCs分化的作用.LIU J等[31]研究发现将IGF-1与BMP-2共同培养TDSCs时，成脂分化标志物PPARγ的表达明显提高，脂肪细胞数量也显著增加，其作用优于两种因子单独使用，表明 IGF-1与 BMP-2可协同诱导TDSCs成脂分化.该研究还进一步证明其是通过激活CREB与 Smad介导PGE2来促进肌腱干细胞的成脂分化的.HGF能够抑制TDSCs的成骨分化.在Han等[32]的研究中将大鼠TDSCs与不同质量浓度的HGF共同培养，发现HGF质量浓度在 10～40 ng/mL范围时，TDSCs成骨标志物基因Col1A1、Alp和Runx2的表达受到抑制，而质量浓度在40～80 ng/mL范围时这些成骨标志物的表达并没有随着质量浓度的升高进一步下降，这表明HGF具有抑制TDSCs成骨分化的作用，其抑制作用并未随质量浓度的升高而增强.EGR-1也是TDSCs分化的重要调节因子.国内学者陶旭[33]从基因转录水平以及蛋白表达等方面证实高表达的EGR-1可以促进TDSCs向腱系分化，同时成软骨、成骨及成脂分化均受到抑制，随后进一步证实EGR-1是通过BMP-12/Smad1/5/8信号通路促进TDSCs向腱系分化的.PGE2在TDSCs的分化过程中也起一定的作用.Liu[31]将大鼠TDSCs与不同质量浓度PGE2(10、50、100、200 ng/mL)共同培养7 d，结果发现成脂分化标志物PPARγ的表达随时间及PGE2质量浓度的增加而增加，而当PGE2质量浓度达到100 ng/mL及作用时间超过7 d后不再增加.这表明PGE2诱导TDSCs成脂分化，并在一定程度内与浓度质量和时间成正相关.另外也有研究发现SP作为重要的促炎症反应介质，通过其受体NK-1R促进TDSCs成脂肪和成软骨分化.周游[34]对比研究了低剂量SP组和高剂量SP组对大鼠跟腱TDSCs的作用.第14及28天取大鼠跟腱标本检测发现两组的成脂分化标志物PPARγ及成软骨分化标志物ColⅡ的表达均明显增高，并且高剂量组的表达高于低剂量组.

综上所述，TDSCs是治疗肌腱损伤的有力工具，但如何在体内诱导TDSCs定向分化是肌腱干细胞发挥临床疗效的关键环节.目前研究已经证明多种细胞因子可以调控其分化方向，部分机制已被阐明，但由于影响因素十分复杂，很多细胞因子的作用还未完全阐明，尤其在体内常常是多种因子共同作用，因此还需进一步深入研究，为TDSCs的临床应用寻求合适的方案.