水分胁迫下不同耐旱性糜子叶片保护酶活性及膜脂过氧化特性

冯晓敏，张永清

(1中国农业科学院作物科学研究所/农业部生理生态重点实验室，北京100081； 2 山西师范大学生命科学学院, 山西 临汾 041004；3.山西师范大学地理科学学院, 山西 临汾 041004)

水分胁迫是农作物生长过程中周期性经历的一种逆境胁迫现象，影响和制约着作物的产量与农业生产发展。据统计，世界上有1/3的可耕作土地面临着水分胁迫[1]。近40年来，中国由于干旱缺水造成的粮食减产已达近1亿t[2]。黄土高原是我国重要的农牧业基地，也是中低产田集中区域，其农业生产受降雨影响很大，筛选水分胁迫条件下仍能保持稳产的作物品种是实现农业可持续发展的根本途径[3]。糜子(PanicummiliaceumL.)属禾本科黍属，是我国古老的粮食作物之一[4]，具有生育期短、耐旱、耐贫瘠、耐盐碱等特性，是北方冷凉地区的主要抗逆渡荒作物，也是良好的填闲作物。近年来关于糜子的研究多集中在抗旱基因[5]、种质资源利用[6]及营养价值分析[7]等方面。在山西中部和北部的旱薄地区，糜子具有明显的生产和区位优势，是该地区主栽的小杂粮作物之一。合理高效地利用有限的水资源对于提高糜子产量、推动糜子产业发展具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试验设计

试验于2010-2011年在山西省农业科学院小麦研究所田间试验基地(北纬35°23′～36°57′，东经110°22′～112°34′)进行。供试材料为本试验室筛选的糜子(PanicummiliaceumL.)品种：耐旱品种陇糜4号和旱敏感品种晋黍7号；其中陇糜4号由兰州大学提供，晋黍7号由山西省农业科学院品种资源研究所提供。采用直径为25 cm，高为30 cm的聚乙烯塑料盆进行盆栽试验。土壤为黄土母质上发育而成的石灰性褐土，含有机质11.2 g·kg-1、全氮720 mg·kg-1、速效磷32 mg·kg-1、速效钾137 mg·kg-1。每盆装土14.0 kg，田间持水量为26.8%， 将肥料(尿素0.49 g·kg-1，过磷酸钙和氧化钾为0.94 g·kg-1)与选用土壤混匀后直接施入盆中。每个处理5次重复，常规栽培管理。共设4个土壤水分处理：W1 正常供水(CK)是田间最大持水量的75%以上，W2 轻度水分胁迫 (65%～70%)，W3 中度水分胁迫 (55%～60%)，W4 重度水分胁迫 (35%～40%)。试验所用种子预先在实验室进行催芽，将种子平铺在含有湿润滤纸的培养皿上，同时用湿纱布覆盖，并保持滤纸和纱布的湿润，待大部分种子露白后，挑选发芽情况一致的种子播种，每盆播种20粒，待幼苗长到三叶一心期时开始定苗，每盆留苗10株，定苗后开始控水处理。土壤水分的控制采用称重法，每天进行称重，当盆质量下降到水分指标下限时，补充水分使其维持在各处理设计的土壤含水量水平。拔节期、抽穗期、灌浆期、成熟期分别在8∶00取样，每盆每次取两株长势基本一致的糜子植株，取叶片后洗净叶片表面的尘土和污物并用吸水纸小心擦干，去除叶脉，混匀，样品用液氮冷冻后，置超低温冰箱中待用。

1.2 测定项目及方法

1.2.1 酶液的提取 取0.5 g鲜样剪碎，置预冷研钵中，加0.05 mol·L-1, pH7.8的磷酸缓冲液(内含1%的PVP)及少量石英砂，在冰浴中研磨提取，4℃，15 000 r·min-1，冷冻离心20 min，上清液定容到10 mL，上清液即为酶提取液。

1.2.2 SOD活性 测定方法参照张志良[22]等方法并加以改进，以抑制50% NBT反应为1个酶活性单位。

1.2.3 POD活性 采用愈创木酚法[22]测定，以ΔOD470g-1FWmin-1表示酶活力单位。

1.2.4 CAT活性 采用钼酸铵比法[22]测定。

1.2.5 MDA含量 采用硫代巴比妥酸法[22]测定。

1.2.6 可溶性糖含量 采用蒽酮法[22]测定。

1.2.7 产量及产量构成因子 成熟期分别测定每盆的穗数、穗粒数和千粒重，并计产。

1.3 统计分析

采用Microsoft Excel 2007处理数据，用SPSS 13.0软件进行数据统计分析，利用单因素方差分析(One-way ANOVA)和最小显著性差异法(Least significant Difference, LSD)比较样本平均数差异的显著性。

2 结果与分析

2.1 水分胁迫对不同耐旱性糜子品种产量及产量构成的影响

表1结果表明，水分胁迫导致植株矮化、生长发育受阻、产量下降，尤其是重度胁迫处理，与对照相比差异显著(P<0.05)，2010年耐旱品种陇糜4号和旱敏感品种晋黍7号的产量在重度胁迫处理下分别比对照下降26.9%和39.2%，2011年分别比对照下降33.1%和37.2%。从产量构成因子来看，水分胁迫后，糜子的穗数、穗粒数和千粒重均下降，下降幅度随胁迫强度的升高而增大，且在重度胁迫下与对照相比差异显著(P<0.05)。旱敏感品种晋黍7号各产量因子受重度胁迫的影响较大。

2.2 水分胁迫对糜子叶片叶绿素含量的影响

如图1所示，各处理的糜子叶片叶绿素含量随着生育时期的延长表现为先升后降趋势，灌浆期达到最大值。与对照相比，轻度水分胁迫(LS)对糜子叶片叶绿素含量影响较小，但重度水分胁迫(SS)的糜子叶片叶绿素含量降幅较大，旱敏感品种晋黍7号的降幅大于耐旱品种陇糜4号，如2010年和2011年，晋黍7号的叶片叶绿素含量在重度胁迫处理(SS)下与对照相比降低26%和22.4%，差异显著(P<0.05)。

表1 水分胁迫对不同耐旱性糜子品种产量及产量构成因素的影响

注：表内数据为平均值+标准差，每列数据后字母相同者表示差异未达显著水平(P>0.05)，字母不同者表示差异达显著水平(P<0.05)。

Note：values are means ±SD. Values followed by a different letter within the same column are significantly different atP<0.05.

2.3 水分胁迫对糜子叶片保护酶活性的影响

由图2可以看出，随糜子生育进程的推进，叶片超氧化物歧化酶活性变化呈现先升后降的趋势，抽穗期达到峰值。水分胁迫降低了SOD活性，尤其是重度胁迫处理，2010年和2011年耐旱品种陇糜4号分别降低20.48%和24.68%，而旱敏感品种晋黍7号SOD活性大幅下降，分别下降39.96%、49.93%，与对照相比差异显著(P<0.05)。表明晋黍7号叶片对超氧阴离子自由基的清除能力较弱，抗衰老能力较弱，而耐旱品种陇糜4号积极参与活性氧的清除过程，保持相对较高的SOD活性。

图3结果表明，水分胁迫导致糜子叶片POD活性下降，中度胁迫和重度胁迫条件下，晋黍7号的POD活性的降低程度要明显高于陇糜4号，说明晋黍7号POD活性对水分胁迫反应比较敏感。随着生育期的推进，POD活性均呈现先升后降的趋势，抽穗期达到最大值。

图4结果表明，整个生育期，CAT活性变化呈现先升后降的趋势，抽穗期达到最大值。水分胁迫导致糜子叶片CAT活性下降，中度胁迫和重度胁迫条件下，晋黍7号和陇糜4号的CAT活性与对照相比显著降低(P<0.05)。

2.4 水分胁迫对糜子叶片丙二醛(MDA)含量的影响

由图5可知，水分胁迫增加了糜子叶片MDA含量，耐旱品种陇糜4号和旱敏感品种晋黍7号在重度水分胁迫处理下增幅分别为30.8%～51%和61.7%～81.6%，与对照相比差异显著(P<0.05)。晋黍7号叶片MDA含量最高，表明其细胞膜结构和功能受伤害程度最严重，叶片衰老进程较快。

注：CK，LS，MS，SS分别为正常灌水、轻度水分胁迫、中度水分胁迫、重度水分胁迫；JS，HS，FS，MS分别为拔节期、抽穗期、灌浆期、成熟期。下同。Note: CK，LS，MS，and SS mean irrigated conditions treatments: normal irrigation, mild stress, moderate stress, and severe stress treatment. JS, HS, FS, and MS mean growth stages: jointing stage, heading stage, filling stage, and mature stage. The same below.图1 水分胁迫对不同耐旱性糜子品种叶片叶绿素含量的影响Fig.1 Effects of water stress on chlorophyll content of leaves of broomcorn millet

图2 水分胁迫下不同耐旱性糜子品种叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性的变化Fig.2 Changes of SOD activities in leaves of different drought-tolerant millet varieties under water stress

图3 水分胁迫下不同耐旱性糜子品种叶片过氧化物酶(POD)活性的变化Fig.3 Changes of POD activities in leaves of different drought-tolerant millet varieties under water stress

图4 水分胁迫下不同耐旱性糜子品种叶片过氧化氢酶(CAT)活性的变化Fig.4 Changes of CAT activities in leaves of different drought-tolerant millet varieties under water stress

图5 水分胁迫下不同耐旱性糜子品种叶片丙二醛(MDA)含量的变化Fig.5 The changes of the MDA content in leaves of different drought-tolerant millet varieties under water stress

2.5 水分胁迫对糜子叶片可溶性糖含量的影响

如图6所示，水分胁迫增加了糜子叶片的可溶性糖含量，在糜子的生理成熟期，重度胁迫处理下晋黍7号的叶片可溶性糖含量在2010年和2011年分别比对照增加44.70%和40.75%。随着生育期的延长，糜子叶片可溶性糖含量均呈现先上升后下降的变化趋势，最大值出现在灌浆期。

2.6 水分胁迫下产量与糜子叶片生理指标的相关性分析

不同生理指标存在一定的必然联系，水分胁迫影响各指标相关性，如表2所示，产量与叶绿素含量、SOD活性，POD和CAT活性呈正相关，与可溶性糖含量和MDA含量呈负相关，此外，叶绿素含量与丙二醛含量呈显著负相关，表明糜子叶片的初生代谢过程和次生代谢过程是紧密相关的，只是不同的生理生化指标对抗旱贡献存在差异。

图6 水分胁迫下不同耐旱性糜子品种叶片可溶性糖含量的变化Fig.6 Changes of soluble sugar content in leaves of different drought-tolerant millet varieties under water stress

指标Indices产量Yield叶绿素含量Chlorophyll contentSOD活性SOD activityPOD活性POD activityCAT活性CAT activity丙二醛含量MDA content可溶性糖含量Soluble sugar content产量 Yield1叶绿素含量Chlorophyll content0.7581SOD活性SOD activity0.8230.8451POD活性POD activity0.7690.8100.6131CAT活性CAT activity0.7840.6250.6050.6581丙二醛含量MDA content-0.712-0.956*-0.812-0.8560.8221可溶性糖含量Soluble sugar content-0.908*-0.847-0.683-0.982**0.8450.938*1

注：*表示0.05水平(双侧)显著相关，**表示0.01水平(双侧)显著相关。

Note: * and ** are significant at 0.05 and 0.01 level, respectively.

3 讨 论

3.1 水分胁迫下糜子产量及其构成因素

水分胁迫是影响旱地作物生长发育的主要逆境，而产量及其构成因子是反映水分胁迫对作物影响的直接指标。本试验中水分胁迫对糜子产量及其构成因素的影响与胁迫程度密切相关，重度水分胁迫下，糜子的穗粒数、千粒重都受到了一定程度的影响，这与前人的结果一致[23-24]。水分胁迫降低了作物的光合能力，破坏了糜子源库关系的协调，导致糜子早衰；同时，水分胁迫下耐旱品种糜子的减产幅度要低于旱敏感品种，说明耐旱品种陇糜4号较旱敏感品种晋黍7号缓解机体损伤的能力更强。在其它谷类作物中也有类似的研究，如任鹏等[25]的研究结果表明，在中度胁迫和重度胁迫下，抗旱品种的燕麦籽粒减产低于同期的水敏感品种。关于糜子所能承受的最大水分胁迫程度以及对水分胁迫最敏感的生育时期需要进一步研究。

3.2 糜子叶片衰老过程中保护酶活性的变化

水分胁迫下作物在体内积累活性氧，破坏了作物正常生长时活性氧产生与清除的平衡，因而通过内源性保护酶促清除系统来维持细胞的正常运行[26]。前人研究发现，SOD、POD和MDA积累量的变化反映了作物对活性氧、自由基的清除能力[18]。SOD和POD酶活力的提高与干旱伤害程度成负相关[16]，本试验研究中，不同耐旱品种叶片的SOD、POD活性在轻度水分胁迫下变化不大，但随着胁迫程度的加剧均有不同程度的下降，可能是由于水分胁迫条件下，作物利用细胞内所具有的保护酶及时清除了活性氧。但王娟等[26]研究发现，在水分胁迫下，SOD和POD活性有上升的趋势[26]。也有研究表明干旱使作物叶片的SOD、CAT和POD活性于作物生育前期增加后期降低[15]。这与本试验结果存在差异。可能是由于不同的研究者所采取的研究体系不同，包括作物材料及胁迫处理的方法存在差异。本研究发现耐旱品种陇糜4号SOD活性和POD活性明显高于旱敏感品种晋黍7号，可能是由于水分胁迫处理下不同品种糜子叶片启动保护酶系统的能力不同，此外，耐旱性强的品种能迅速对水分胁迫做出响应，激活体内的保护酶以清除自由基，从而缓解胁迫带来的伤害。糜子叶片SOD活性和POD活性在生育前期增加幅度较大，可能是糜子对水分胁迫的响应机制减轻糜子在水分胁迫下遭受的损伤，并增强糜子生育后期对水分胁迫的抵抗力。

水分胁迫下作物器官和细胞内首先受伤害的是细胞膜，膜系统的过氧化作用能导致细胞的衰老[23]。MDA含量可以反映糜子遭受水分胁迫时的破坏程度，研究表明，水分胁迫增加了糜子叶片MDA含量，表明作物体内细胞酶系统平衡体系被打破，活性氧过量积累，导致MDA和质膜透性增加，促进了膜脂过氧化作用，使细胞膜受破坏[23]；这与前人的研究相似[27]。旱敏感品种晋黍7号在不同生育时期和不同胁迫程度下MDA含量增加的幅度大于耐旱品种陇糜4号，且增幅在抽穗期表现得更加明显，表明陇糜4号膜脂过氧化程度较低，膜受伤较轻，膜完整性破坏较晋黍7号滞后，由于作物在灌浆期体内大部分细胞开始衰老，此时对水分胁迫的反应比较迟钝。

本研究表明，水分胁迫下，膜脂过氧化物MDA含量增加，但是酶促防御系统的POD活性并未提高。糜子叶片SOD、POD保护酶活性下降与MDA积累有关，一方面，由于糜子叶片SOD、POD活性下降，使有害自由基积累，当超过伤害阈值时，可能直接或间接地启动膜脂过氧化作用使MDA含量增加，膜完整性被破坏；另一方面，随着MDA含量的增加又抑制了糜子叶片SOD、POD的活性，从而丧失了保护酶系统的功能，进一步促使膜系受损加重。这可能是水分胁迫下糜子叶片的主要生理反应及损伤机理。

3.3 水分胁迫对糜子叶片渗透调节物质含量的影响

渗透调节作用是作物抵御逆境胁迫的重要机制。农作物主要的光合产物之一可溶性糖是重要的渗透调节物质和脱水保护物质[28]。水分胁迫使糜子缺水严重，可溶性糖含量的增加可引起其它生理代谢的响应，如原生质粘度增大等，从而提高作物的保水能力和吸水能力，有利于适应缺水的环境，维持水解类酶如蛋白酶等的稳定性，进而保持原生质体结构。本试验中随着水分胁迫程度的增加，各生育期不同处理可溶性糖含量增加幅度不同，在糜子生长前期以营养生长为主，需水量较大，CK的可溶性糖含量较高；但灌浆期是糜子生长旺盛时期，其体内代谢较快，积累的可溶性糖含量较多，水分需求量较大，对水分比较敏感，此时期的水分胁迫处理可溶性糖含量较高；水分胁迫后期糜子叶片的可溶性糖含量下降，可能是糜子后期逐步适应干旱环境，能调节自身物质代谢，同时叶片中的可溶性糖含量逐步转化为籽粒营养，从而使可溶性糖含量下降。这是由于在干旱初期可溶性糖含量增加有促进同化物质运输的作用，而持续干旱对物质运输起到了抑制作用[23]。总之，水分胁迫下糜子叶片中可溶性糖含量增加进而提高其渗透调节能力影响产量。

水分胁迫导致光合电子传递链的过度还原，产生的活性氧不仅对酶促防御系统造成破坏，同时使保护酶丧失有效清除超氧阴离子、OH-等自由基的能力。本研究虽然表明SOD、POD、CAT可能参与了糜子叶片衰老进程的调控，但是植物只有启动整个防御系统才能抵抗水分胁迫造成的氧化伤害，单一的抗氧化酶均不足以防御这种氧化胁迫；同时，作物体内抗氧化胁迫的模式也不相同，有些以酶性为主，有些可能使非酶性为主；同时，抗氧化系统包括抗坏血酸-谷胱甘肽循环系统(ASA-GSH)和抗氧化酶类[29-30]，而本研究只进行了一些抗氧化酶的分析。因此，水分胁迫下作物如何协调保护酶及非酶性为主的过程从而使活性氧伤害降低到最大程度的内在机制，还需进行深入研究。