养阴镇静丸质量标准提高研究

孙小萌，笔雪艳，曲范娜，李再红，朱胜男，徐兵

(1.黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江省食品药品检验检测所，黑龙江 哈尔滨 150001；3.吉林恒金药业股份有限公司，吉林 梅河口 135100)

养阴镇静丸由当归、麦冬、五味子、首乌藤、生地黄、茯苓、柏子仁、党参、珍珠母、玄参、丹参、远志、桔梗、朱砂14味药组成。该品种原标准收载于《中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂》第十九册， WS3-B-3615-98是原标准号。原标准内容只包括性状、当归和丹参的薄层色谱鉴别及检查项。为了提高标准的可控性及可操作性，对该标准进行了完善和提高。对原标准中的当归和丹参薄层鉴别做了方法学验证。因当归和远志鉴别阴性干扰，最后删除了当归的薄层鉴别，研究建立了五味子、珍珠母、茯苓、和朱砂的显微鉴别，增加了五味子醇甲的含量测定方法，经方法学验证，表明该测定方法准确可行。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Thermofisher U3000高效液相色谱仪， DAD检测器；Nikon 50i荧光显微镜；AE-240电子天平；DK-98-1型双列六孔水浴锅。色谱柱：Techmate C18-ST(4.6 mm×250 mm，5 μm)。

1.2 试药 五味子醇甲(中国药品与生物制品检定所，批号110857-201412)；乙腈为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。

2 显微鉴别

原标准中，没有显微鉴别项。通过对3批成品进行显微观察，增加了五味子、珍珠母、朱砂和茯苓的显微鉴别。五味子[1]鉴别特征为种皮表皮石细胞表面观呈多角形或长多角形，直径1850 μm，壁厚，孔沟极细密，胞腔内含深棕色物(见图1)。珍珠母[1]鉴别特征为不规则碎块表面多不平整，呈明显的颗粒性，有的呈层状结构，边缘多数为不规则锯齿状(见图2)。朱砂[1]的鉴别特征为不规则细小颗粒暗棕红色，有光泽，边缘暗黑色(见图3)。茯苓[1]的鉴别特征为不规则分枝状团块无色，遇水合氯醛试液融化(见图4)；菌丝无色或淡棕色(见图5)。

图1 五味子石细胞显微鉴别(×40)

图2 珍珠母显微鉴别(×40)

图3 朱砂的显微鉴别(×40)

图4 茯苓团块的显微鉴别(×40)

图5 茯苓菌丝的显微鉴别(×40)

3 五味子醇甲的含量测定

3.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱为Techmate C18-ST(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相A为乙腈，B为水，进行梯度洗脱(梯度见表1)；检测波长为217 nm。流量为1 mL·min-1;理论板数按五味子醇甲峰计算应不低于2 000。

表1 梯度洗脱条件

3.2 对照品溶液的制备[2]取五味子醇甲对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含五味子醇甲10 μg的溶液，即得。

3.3 供试品溶液的制备[3-4]取重量差异项下的本品1丸，剪碎，加等量硅藻土，研匀，取约3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25 mL甲醇，密塞，称定重量，超声30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.4 阴性对照溶液 按比例取五味子以外的处方药适量，按制法制成五味子的阴性对照样品，取相当于0.5 g的量，加甲醇溶液，按上述供试品溶液制备方法制备阴性对照液。

3.5 线性关系考察[5]取五味子醇甲对照品，经精密稀释浓度补差29.13、19.42、9.71、4.86、0.97 μg·mL-1，制备5个浓度的对照品溶液，进样量均为10 μL，按含量测定方法测定峰面积，横坐标是对照品样品量，纵坐标为峰面积的积分值建立标准曲线，计算回归方程，回归方程为：Y=737.800 0X-0.018 8，r=1.000 0，五味子醇甲在0.97～29.13 μg·mL-1范围内线性关系良好。

3.6 精密度试验 吸取对照品溶液10 μL，连续进样5次，依法测定五味子醇甲的峰面积，结果五味子醇甲的峰面积RSD值为0.1%，说明仪器精密度良好。

3.7 稳定性试验 取同一供试品(批号：20180403)，分别在制备后0、2、4、6、8、10、16、24 h测定五味子醇甲的峰面积,结果24 h内五味子醇甲的峰面积的RSD为0.2 %，证明供试品制备后24 h内测定结果稳定。

3.8 重复性试验 分别精密称取批号为20180403的样品6份，按“3.3”项下方法制备供试品溶液，按照上述方法测定，按外标法计算供试品中五味子醇甲的含量。结果五味子醇甲的平均含量为0.199 8 mg·g-1,样品的RSD值为1.7%，重复性结果良好。

3.9 回收率试验 精密称取已知含量的样品(批号20180403)6份，每份约1.5 g。精密称定，6份样品中各精密加入对照品溶液25 mL(浓度=0.005 826 mg·mL-1，相当于对照品0.145 7 mg)。按“3.3”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，并测定含量，计算回收率，结果见表2。本检测方法具有较好的回收率。

回收率=(加标样品测得量-样品含量)/加对照品量×100%

表2 回收率测定结果

3.10 专属性试验 取对照品溶液，供试品溶液，及阴性对照溶液，按上述色谱法测定。结果供试品色谱中呈现与对照品色谱峰保留时间相应的色谱峰，结果表明处方中除五味子外的其他药味对五味子醇甲的测定无干扰。色谱图见图6。

A对照品；B供试品；C阴性对照 1五味子醇甲图6 专属性试验HPLC色谱图

3.11 含量测定与限度的确定 按上述色谱条件和样品制备方法，测定了10批样品中五味子醇甲的含量，结果见表3。暂定含量测定限度为10批样品含量测定平均值的80%为最低含量，既每丸含五味子以五味子醇甲计，不得少于1.35 mg。在养阴镇静丸中，五味子粉碎后直接制丸，《中国药典》2015年版(一部)中对五味子药材中五味子醇甲含量限度的要求为不得少于0.4%。养阴镇静丸的限度相当于五味子中含五味子醇甲应不得少于0.43%，更加严格的控制了产品的质量。

表3 10批养阴镇静丸中五味子醇甲的含量

3.12 范围 取批号为20180403的样品，根据中药质量标准分析方法验证指导原则的要求，参照相关资料，对本制剂所规定的含量限度的50%与150%进行范围测定，分别测定3组数据，将此6组数据与样品测定的3组数据进行RSD的计算，结果RSD小于2.0%，见表4。表明在此范围内，含量测定方法较为准确。

表4 养阴镇静丸的范围测定结果

4 讨论

4.1 检测波长的选择[6]取五味子醇甲对照品适量，制成每1 mL含40 μg的溶液,设置DAD检测器在190～400 nm范围内进行波长扫描，结果显示五味子醇甲溶液在217 nm处有最大吸收，故选择217 nm作为测定波长。

4.2 提取溶剂的选择[7]根据五味子醇甲自身溶解性特点，考察了甲醇和乙醇两种提取试剂制备供试品溶液，依法测定五味子醇甲的含量。结果显示甲醇的提取效率明显高于乙醇，故选择甲醇为提取溶剂。

4.3 提取方法的选择[8]考察了4种提取方式，分别为超声30 min，超声1 h，加热回流30 min，加热回流1 h。测定结果显示4种提取方法的并无明显差异。故选择超声30 min作为提取方法。