超声波法提取凌云白毫茶中的咖啡碱*

，，，，，，

(1. 右江民族医学院2016级药学专业本科，广西 百色 533000；2. 右江民族医学院药学院，广西 百色 533000)

茶叶有解毒、利尿、止泻、消炎等功效，茶叶中已知化学成分有上百多种，主要成分有生物碱(咖啡碱为主要)、茶多酚、氨基酸、黄酮类等[1-3]。

咖啡碱，又名咖啡因(caffeine)，化学名称1，3，7-三甲基黄嘌呤(1，3，7-trimethylxanthine)，化学式C8H10N4O2，相对分子量为194.2，属于黄嘌呤生物碱化合物，咖啡碱物理特性，无味，白色针状或粉状固体，微溶于水，可溶于乙酸乙酯、氯仿、酒精、丙酮等[4]，其熔点为237℃，沸点(升华)为178℃。咖啡碱是传统的中枢神经系统兴奋剂，适度地使用可以驱除疲劳、兴奋神经的作用，临床上用于治疗神经衰弱和昏迷复苏。但是大量使用或者长期服用咖啡碱，会引发阵发性惊厥和骨骼震颤，损害肝、胃、肾等重要内脏器官，诱发呼吸道炎症等疾病，有可能导致下一代的肢体畸形、智能低下，因此，咖啡因也被列入受国家管制的精神药品范围。凌云白毫茶是享誉全国的百色特产，提取实验是研究凌云白毫茶各有效成分药用价值的基础，但目前罕有关于凌云白毫茶中咖啡因提取的研究，为了进一步研究凌云白毫茶的药物价值，所以我们开展凌云白毫茶中咖啡碱的提取研究。

1 材料及方法

1.1 材料 无水乙醇(AR级别纯度)；生石灰粉(AR级别纯度)；凌云白毫茶(产于百色凌云县)。

1.2 仪器 FZ-102植物粉碎机；FA1104型电子天平；数控超声波；亚荣RE-3000旋转蒸发仪；HH-S4A恒温水浴锅；酒精灯；石棉网；漏斗；蒸发皿。

1.3 实验方法

1.3.1 咖啡碱粗品的提取 称取5 g研碎的凌云白毫茶茶末放入250 ml烧杯中，加入一定体积和一定浓度的乙醇，用保鲜膜密封烧杯瓶口。置于超声波中，在不同超声功率中放置一定时间，取出后放到70℃水浴锅中反应40 min，冷却后过滤，减压蒸馏浓缩提取液，当液体体积为3 ml，得到咖啡碱浓缩物。

1.3.2 咖啡碱的精制 将咖啡碱浓缩物置于蒸发皿中，加入氧化钙，放置于酒精灯中加热，在蒸发皿上放一张刺有均匀小孔的滤纸，再盖上一个直径与蒸发皿一样大小的玻璃漏斗，在漏斗颈部塞入少量棉花，缓慢加热，使咖啡碱升华，升华温度控制在120℃～178℃。当滤纸上方出现白色针状结晶，调节蒸发皿高度，使得升华速度减慢，以便提高咖啡碱纯度和提取率。有棕色烟雾出现，停止加热。待蒸发皿冷却，取下漏斗与滤纸，用药勺刮下咖啡碱，称重。

1.4 正交试验 为了提高凌云白毫茶提取率，通过单因素试验结果，选择4个因素乙醇浓度、超声时间、超声功率、液固比作为参考因素，设计4个因素3水平正交实验，影响因素和水平见表1。

表1 超声波乙醇法提取凌云白毫茶的正交实验因素和水平

2 结果

2.1 不同乙醇浓度对咖啡碱提取量的影响 称取5 g研碎的凌云白毫茶茶末放入250 ml烧杯中，加入100 ml 35%、50%、65%、80%、95%的乙醇，置于数型超声波中，在功率为120 W中的数型超声波中超声30 min，取出后放到70℃恒温水浴锅中反应40 min，冷却后过滤、浓缩、加入氧化钙、烘干、升华称取咖啡碱质量，实验结果见图2。由图2可知，咖啡碱提取量在35%～95%乙醇浓度范围内随着浓度的增加而增加，说明乙醇浓度对咖啡碱的提取量具有较大影响。乙醇浓度为95%时其提取量最大为44.1 mg。

图2 乙醇浓度对咖啡碱提取量的影响

2.2 不同超声时间对咖啡碱提取量的影响 量取100 ml 80%乙醇，在功率为120 W的条件下超声10 min、20 min、30 min、40 min、50 min，之后放到70℃水浴锅中反应40 min。图3为咖啡碱的提取量随时间的变化。由图3可知，超声时间在10～50 min之间变化时，咖啡碱的提取量先增加，后趋于平稳稍有下降，超声时间为30 min时咖啡碱的提取量最大为43 mg，说明超声时间对咖啡碱的提取量有一定的影响。超过30 min后咖啡碱的提取量稍有减少。

图3 超声时间对咖啡碱提取量的影响

2.3 不同超声功率对咖啡碱提取量的影响 量取100 ml 80%乙醇，在超声功率为40 W、80 W、120 W、160 W、200 W的条件下，超声30 min，之后放到70℃水浴锅中反应40 min。图4为其在不同超声功率下咖啡碱提取量。由图4可知，超声波功率在40 W～200 W范围之间时，咖啡碱提取量随着功率升高而增加，但是功率升高至一定值，咖啡碱的提取量反而降低，咖啡碱的提取量在功率120 W时达到最大值为45 mg，说明超声功率超过一定范围咖啡碱提取量受影响。

图4 超声功率对咖啡碱提取量的影响

2.4 不同的固液比对咖啡碱提取量的影响 量取50 ml(液固比10∶1)、75 ml(液固比15∶1)、100 ml(液固比20∶1)、125 ml(液固比25∶1)、150 ml(液固比30∶1) 80%乙醇，在超声功率为120 W的条件下，超声30 min，之后放到70℃水浴锅中反应40 min。图5为不同液固比所得到的咖啡碱提取量。由图5可知，液固比在10∶1～30∶1范围之间时，咖啡碱的提取量随液固比的变化呈现规律性改变，其中液固比是30∶1最大，此时的咖啡碱的提取量为40.1 mg，而液固比是25∶1时咖啡碱的提取量为40 mg，变化不大。实验表明液固比对咖啡碱的提取量有一定的影响，且液固比到达一定值后，其对咖啡碱提取量的影响减少。

图5 液固比对咖啡碱提取量的影响

2.5 正交试验 为了提高凌云白毫茶中咖啡碱的提取率，在单因素试验的基础上，采用正交试验L9(34)，考察了4个影响因素和3水平9次实验对提取量的影响，研究结果见表2。表2中R为各因素的极差，反映各因素影响实验指标的程度。R越大，说明该因素对实验指标的影响就越大，其影响就越重要。从极差结果分析可知，以咖啡碱提取量为考察指标，4个因素对咖啡碱提取量的影响由大到小依次为因素A(乙醇溶度)、因素C(超声功率)、因素D(液固比)、因素B(超声时间)。从表2可以看出，正交实验范围内的最佳提取条件为A3B2C2D2，即乙醇浓度95%，超声时间30 min，超声功率120 W，液固比25∶1。在最佳提取条件下，得到凌云白毫茶中咖啡碱提取量的为66 mg，通过重复实验验证，发现该方法具有很好重现性。

表2 L9(34)的正交实验及结果

3 讨论

不同的提取方法对天然药物成分的药用效果会产生不同的影响[5-6]。目前，从茶叶中提取咖啡碱成分的主要方法有：水提法、醇提法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法等[7-10]。提取实验是研究凌云白毫茶各有效成分药用价值的基础，但目前关于凌云白毫茶中咖啡因提取的还有待进一步研究。所以我们以凌云白毫茶为实验原料，采用超声波法辅助乙醇作为溶剂提取咖啡碱，咖啡碱的提取量为评价指标，先采用单因素试验研究，再设计正交试验，最终得出的最优提取工艺为：95%乙醇浓度，超声时间30 min，超声功率120 W，液固比25∶1。正交试验得到粗提产物之后，再进行浓缩蒸馏，从升华温度差异入手，从而可以在咖啡碱粗品中提取出精品咖啡碱。在最佳的提取条件下，我们可以从5 g凌云白毫茶中提取66 mg咖啡碱，咖啡碱的收率达到1.32%，与其它茶叶的相关研究相比[11]，结果满意。另外，超声波法还有简单易行、无环境污染物废液废渣和提取纯度高等优点，为凌云白毫茶药物价值的进一步研究提供了基础，对其它天然植物有效成分提取也有着重要的参考价值。