新疆畜间布病分子流行病学特征分析

2019-03-02马晓菁刘丽娅谢彩云谷文喜马俊杰易新萍

新疆农业科学 2019年12期

马晓菁，叶锋，刘丽娅，刘帅，谢彩云，谷文喜，钟旗，马俊杰，易新萍

(新疆畜牧科学院兽医研究所，乌鲁木齐 830013)

0 引言

【研究意义】布鲁菌病(Brucellosis，简称布病)是由布鲁菌(Brucella)引起的一种严重危害畜牧业生产和人类公共卫生安全的人畜共患病[1]。新疆是我国五大牧业基地之一，畜牧业在国民生产总值中占有非常重要地位，主要以布鲁菌病属的羊种菌和牛种菌为优势菌种的农、牧区型和城市型布病老疫区[2]。近年来，随着家畜规模化养殖的兴起和牲畜流动的加快，畜间布病发病率呈明显上升趋势，人间布病的发病数也逐年递增[3]。由于带菌动物是其他动物和人类布病的主要传染源，因此，从源头遏制畜间布病疫情上升趋势是控制人间布病的重要前提。多位点可变数目串联重复序列分析(multiple locus variable number tandem repeat analysis，MLVA)是近年发展起来的以PCR为基础，根据被检菌株散在基因组中不同位点的、变数量串联重复序列( variable number tandem repeat，VNTR)的重复单元拷贝数的差异进行分子分型的技术[4]。【前人研究进展】多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)技术具有高分辨率优势的多态性遗传标记，在评价疫苗效果、种系间遗传与进化以及疾病爆发的追踪等方面起着重要作用。MLVA技术在布鲁菌分型上应用较为广泛，2003年Bricker等[5]将高变量八聚物寡核苷酸指纹技术(HOOF-Prints)应用到布鲁菌的菌型鉴定中。随着MLVA分型技术迅速发展，对VNTR位点的选择也相对多样化，根据VNTR数目的不同衍生出MLVA-15、MLVA-16、MLVA-17和MLVA-21等多种方案[6-7]。Marianne等[8]用MLVA-16对海洋哺乳动物布鲁菌株分型，海洋动物布鲁菌与陆地动物布鲁菌存在差异，主要分为3个生物型。近年来，在我国利用MLVA技术对不同地区分离布鲁菌进行分型鉴定以及遗传关系比较研究，用于追溯传染源，确定流行趋势。杨杰等[9]初步建立我国布鲁菌MLVA-16分型方法。毛玲玲等[10]采用MLVA-16对辽宁地区人间分离33株布鲁菌分型，研究结果表明，该地区布鲁菌流行菌株存在丰富的基因多态性。任晓丽[11]等对1株新疆分离绵羊附睾种布鲁菌MLVA-16方法结合常规生物学方法分析，结果显示两种分型方法种属结果一致。【本研究切入点】为掌握新疆畜间布病流行病学特征，研究通过多重PCR方法和MLVA技术[12-14]对新疆2010-2015年分离的布鲁菌进行基因分型研究。【拟解决的关键问题】分析新疆畜间布病的流行特征及菌型基因特征情况，为新疆制定布病综合性防控措施提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

对照标准菌株A19、M5和牛种3型布鲁菌的DNA、牛羊布鲁菌分离株均由新疆畜牧科学院兽医研究所布病组保存。

布氏琼脂和肉汤培养基(美国BD公司)。PCR相关分子生物学试剂和细菌核酸提取试剂盒(北京全氏金生物技术有限公司)。PCR引物由上海英俊生物工程有限公司合成，PCR产物由北京鼎国生物工程有限公司测序。

1.2 方法

1.2.1 AMOS-PCR法鉴定布鲁菌种/型

参照参考文献[15-16]中的AMOS-PCR方法及参数对新疆布鲁菌分离株进行布鲁菌种/型的鉴定。

1.2.2 布鲁菌MLVA分子分型

采用MLVA-16(16位点可变数目串连重复序列)分型方法，引物序列、扩增体系及反应条件见文献[17]。16个引物分为2组：panel 1( Bruce06、Bruce08、Bruce11、Bruce12、Bruce42、Bruce43、Bruce45、Bruce55 ),panel2A ( Bruce04、Bruce07、Bruce09 ) ，panel 2B ( Bruce16、Bruce18、Bruce19、Bruce21、Bruce30) 。MLVA反应体系为25 μL：2×TaqPCR mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，模板DNA1.0 μL，ddH2O补至反应体系25.0 μL，扩增参数：95℃预变性5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环，72℃ 5 min。Panel1的PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳，1.8%琼脂糖凝胶电泳，100 V，30 min。Panel 2的PCR产物采用毛细管电泳。其中panel 2引物上游5’端标记荧光素(FAM)进行PCR扩增，PCR产物由北京鼎国生物工程公司测序。

1.3 数据处理

将扩增所得的PCR产物通过BioNumerics数据统计转化为各位点的重复单元。通过http://mlva.u-psud.fr/MLVAnet与数据库进行比较，以确定分型。应用非加权配伍组平均法(UPGMA)进行聚类分析，将获得的布鲁菌分型与国际Brucella数据库在线比较并进行遗传进化树分析。

2 结果与分析

2.1 AMOS-PCR结果

研究表明，牛种布鲁菌(1，2，4，3a型)扩增出498 bp的特异性片段，牛种布鲁菌(3b，5，6，9型)扩增出1 700 bp的目的片段，羊种布鲁菌(1，2，3型)扩增出731 bp的目的片段。新疆地区的30株布鲁菌分离株有26株为羊种布鲁菌，4株为牛种布鲁菌。图1

M：Marker(DL2000)；1：羊种布鲁菌M5疫苗株；2：牛种布鲁菌A19疫苗株；3：牛种9型布鲁菌；4：阴性对照；5-34：布鲁菌分离株

2.2 布鲁菌株MLVA位点串联重复数

将16个VNTR位点的重复序列进行PCR扩增，将扩增所得的PCR产物通过BioNumerics数据统计转化为各位点的重复单元数。表1

表1 新疆布鲁菌分离株MLVA位点串联重复数Table 1 MLVA tandem reapeat of Brucella isolated in Xinjiang

2.3 新疆布鲁菌MLVA-16聚类

MLVA-16分型方法中panel 1引物扩增结果显示，30株布鲁菌有26株为羊种布鲁菌，4株为牛种布鲁菌，结果与AMOS-PCR种/型分型结果一致。BioNumerics6.6软件聚类分析表明，新疆地区30株布鲁菌可被分为10大基因群(A～J群)22个基因型。其中A群包含4个基因型4株菌，均与牛种布鲁菌群聚为一簇。B～J群均与羊种布鲁菌聚为一簇，其中B群、C群、D群及F群均为独立基因型6株菌。E群包含3个基因型3株菌，G群包含4个基因型8株菌，H群包含2个基因型2株菌，I群包含2个基因型4株菌，J群包含3个基因型5株菌。图2

图2 新疆30株布鲁菌分离株的MLVA-16聚类Fig.2 Dendrogram based on the MLVA-16 genotyping assay of the 30 Brucella strains in xinjiang

3 讨论

分离病原是确诊布病的金标准，而对病原的种型鉴定是控制、预防和根除布病的重要环节。布鲁菌传统的细菌学鉴定方法虽可以对病畜做出确切的诊断，但鉴定耗时，操作步骤繁琐，且对实验室操作人员具有较高的感染风险。MLVA分子分型方法具有快速、操作简单、重复性好等优点,且便于实验室间的比较，可以作为传统表型鉴定方法的补充[18-19]。研究中应用MLVA-16分型方法对新疆2010～2015年间21个县/市分离的30株布鲁菌从种、型、株水平进行鉴定，对菌株间的亲缘关系开展分析研究，掌握了新疆畜间布病传染源分布和疫情流行特征，为新疆制定布病综合性防控方案提供前期基础。

截止1990年，新疆从人体内分出的布鲁菌主要以牛种菌占优势[20]。全国近年的布病病原学监测结果表明，羊种3型布鲁菌是我国人间布病的主要流行菌型，其次是牛种菌[10、21-22]。研究中MLVA-16聚类分析显示，4株牛种布菌有3株在panel 1的8个位点均为4-5-3-12-2-2-3-1，并有2株panel 2A的3个位点 (Bruce18、Bruce19、Bruce21)也全部一致(6-21-8)；panel 1的4-5-3-12-2-2-3-1为牛种布鲁菌的主要感染病原菌。与国内牛种布鲁菌(重庆、黑龙江、河北、内蒙古)相比，新疆牛种布鲁菌为独立基因型，推测新疆是牛种布鲁菌自然疫源地。尽管国内分离的90%布鲁菌均属于羊种布鲁菌，但不同地域的基因型也存在一定差异。中国南方(浙江、云南、福建省)与北方(山西、内蒙古、辽宁、河北、山东、陕西)的布鲁菌明显属于两个独立基因群。新疆26株羊种布鲁菌中只有WS2株与山东分离株聚为一群(B群)，其他25株羊种菌均属于独立的基因型，即8个基因群(C～J群)17个基因型，新疆地区目前流行的布鲁菌存在丰富的基因多态性。24株羊种布鲁菌在panel 1的8个位点均为42型(1-5-3-13-2-2-3-2)，属东地中海型；panel 2A的3个位点 (Bruce18、Bruce19、Bruce21)也全部一致，均为4-20-8 型。在panel 2B的5个位点(Bruce04、07、09、16、30)中，Bruce04、Bruce07、Bruce09也有13株是完全相同的，均为4-4-3型；有4株菌的panel 2B的5个位点完全相同4-4-3-6-5(为G型)，羊种布鲁菌在时间和区域上的感染源是相关联的。G群基因型( 30.77% ) 为新疆目前主要的流行基因型。布鲁菌MLVA-16聚类分析表明，新疆畜间布鲁菌感染的主要流行病原菌为羊种42型，属于东地中海型。

布鲁菌的各型菌有其主要的感染宿主，但也能转移于其它宿主，各型布鲁菌在不同种动物间有跨物种间传播现象[23]。从基因型多态性来看，研究中分离的7株羊种菌的宿主来源于牛，但其广泛分布于5个基因群的6个基因型中。从菌株分离地点分析，阿勒泰地区分离的8株布鲁菌广泛分布于6个基因群的8个基因型中，菌株之间的亲缘关系较远。南疆和北疆地区分离的布鲁菌可聚类在相同基因型中(CBC1、HT1)，以上结果表明新疆分离到的布鲁菌株显示出丰富的基因多态性现象。综上所述，近几年新疆人间布病疫情明显呈现扩大蔓延之势，主要与畜牧养殖生产活动有关。一方面，疆内外牲畜养殖量大规模发展与牲畜交易日益频繁是导致布病疫情上升的一个主要原因。另一方面，牲畜检疫、免疫及无序移动的监管无保障。众所周知，在不同的国家和地区，以至在一个国家的不同地方，各种动物作为传染源的意义不尽相同[24]。