我国中华蜜蜂、熊蜂、黑小蜜蜂感染蜜蜂丝状病毒情况调查

杨大贺 邓炎春 杨卅 侯春生 刁青云

（1 中国农业科学院蜜蜂研究所，北京 100093；2 中国农业科学院研究生院， 北京 100081）

1 引言

蜜蜂是自然界重要的授粉昆虫，对生态系统的平衡及生物多样性具有重要意义。近年来，蜜蜂健康及蜂群的大量损失越来越受到国际社会的关注[1]。其中，威胁蜜蜂健康的主要因素有新烟碱类农药、蜂螨、细菌病、真菌病及病毒病[2]。蜜蜂常见的病毒病主要是单链正义RNA病毒，已报道的能感染蜜蜂的RNA病毒超过了30种，如常见的IAPV（Israeli acute paralysis virus）、BQCV（black queen cell virus）、DWV（deformed wing virus）、SBV（sacbrood virus）等[3]，而针对DNA病毒（如蜜蜂丝状病毒）现有的研究较少。目前，只有少量文献报道了蜜蜂丝状病毒（AmFV）。AmFV具有囊膜，丝状核衣壳长约3150×40nm，包裹在一个大小为450×170nm的杆状粒子中[4]。Gauthier等人[5]在2015年报道了AmFV全序列，其全长具有约498500个核苷酸，编码247个非重复阅读框。对基因组信息分析后发现，其中的13个开放阅读框与杆状病毒口服感染因子（pifs）具有较高的相似性。AmFV在欧洲意大利蜜蜂上发现报道后，中国也在意蜂和其本土蜂种中华蜜蜂上发现[6]，并且广泛分布于意蜂蜂群，大部分以隐性感染为主[7]。AmFV流行广泛，几乎在蜂群中无处不在，蜂王、雄蜂、工蜂及其不同发育历期和食物中均能检测到AmFV。虽然AmFV似乎对蜜蜂没有明显的致病症状，但是其在蜂群中流行及传播的机制还不清楚。

因此，本研究拟对其他授粉蜂如野生中华蜜蜂、熊蜂及黑小蜜蜂感染蜜蜂丝状病毒的情况进行调查，以期进一步了解丝状病毒在不同授粉昆虫的发生与分布。

2 材料与方法

2.1 实验材料与设备

本实验中的中华蜜蜂采自广东省，欧洲地熊蜂采自北京市，中国意蜂样本来自湖北和山东省，韩国意蜂来自韩国安东地区，黑大蜜蜂、黑小蜜蜂和无刺蜂样品来自云南昆明。所有蜂样本均为采集蜂，无明显可见蜜蜂疾病症状。

实验试剂：检测所用的PCR酶为南京诺唯赞2×Taq Master Mix，琼脂糖胶为Lowest Regular Agarose G-10（上海贝晶生物技术有限公司），DNA maker（DL5000与DL15000）来自Takara公司，平末端克隆试剂盒（CV16-Zero Background pTOPO-Blunt Cloning Kit）购自北京艾德莱生物科技公司，胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自Omega Bio-tek生物公司（武汉）。引物合成及样品测序送至上海生工生物科技有限公司（武汉分公司）进行测序。

表1 实验中用到的主要仪器信息

2.2 实验方法

基因组DNA提取：取1～2只蜜蜂加入1ml细胞裂解液，加入小钢珠在组织破碎仪上研磨，加入20μl（500μg/ml）蛋白酶K，65℃水浴30min。12000rpm，离心5min，取上清。加入等量（约600μl）酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）混合液（这个溶液是成品），混匀，12000rpm，5min。取上清加入等体积氯仿，混匀静置3min，12000rpm，离心5min，取上层溶液。加入2倍体积乙醇，室温2min，12000rpm，10min，弃去上清。加入1ml 70%乙醇，12000rpm，离心5min，弃去上清。室温风干10min，乙醇一定要挥发干净。加入100μl DDW，65℃溶解10min（要看最后沉淀量的多少，一般都会很多，就加DDW 100μl，如果最后沉淀量很少，就先加20μl，测浓度）。

图1 鉴定不同蜂种感染AmFV

PCR扩增目的片段：实验过程中所用的检测引物[5]，正向引物F：CAGAGAATTCGGTTTTTGTGAGTG，反向引物R：CATGGTGGCCAAGTCTTGCT，片段大小约为550bp。检测AmFV的PCR反应条件为：预变性，95℃，3min，变性95℃，15s，退火，55℃，15s，延伸72℃，15s，总延伸，72℃，5min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，于凝胶成像系统观察其目的片段。

表2 不同蜂种AmFV感染率

3 实验结果

3.1 多种蜂AmFV感染的鉴定

AmFV目的片段PCR扩增产物经凝胶电泳分析，在550bp左右可见清晰特异性条带，如图1。发现中国的中华蜜蜂、意大利蜜蜂，韩国的意大利蜜蜂、熊蜂和黑小蜜蜂均感染了AmFV。

3.2 不同蜂种AmFV的感染率

为了进一步了解不同种蜂携带AmFV的潜在风险，本实验对所采集的蜂样进行单只检验，分别计算其总体感染率。发现意大利蜜蜂感染率最高，达90%，黑小蜜蜂感染率达80%，即使感染率最低的熊蜂也达到40%。表明AmFV不仅在规模化蜂群中出现，野生授粉蜂也已受到感染。

4 讨论

本研究首次报道了我国野生蜂种，如黑小蜜蜂、熊蜂感染AmFV，表明AmFV的感染已经向野生种群扩散。虽然目前未检测到黑大蜜蜂和无刺蜂感染AmFV，但是由于样本量的有限，并不代表这两个蜂种没有感染AmFV。另外，由于大多情况下AmFV建立的是隐性感染，不产生明显的疾病症状，不易发现，等发现时已造成严重损害。因此，进一步监测野生授粉昆虫的感染情况是很有必要的。

本实验通过检测膜翅目蜜蜂科的昆虫样品，如熊蜂、黑小蜜蜂等昆虫，不仅在中蜂和意蜂中发现了AmFV病毒的存在，而且在熊蜂、黑小蜜蜂中也发现AmFV存在，表明AmFV在膜翅目昆虫中具备一定的感染传播能力。蜜蜂的RNA病毒宿主较多，比如IAPV等其他病毒可在蜂螨、蚂蚁、蜡螟、小甲虫等中检测到[8,9]，这说明其具备一定的跨宿主传播能力，但是否能够在这些载体中检测到还需进一步研究。同时，本研究也未检测其他蜜蜂病虫害，例如蜜蜂微孢子虫。研究表明，蜜蜂微孢子虫对AmFV的流行与发生具有重要的推动作用，能够使AmFV的隐性感染变成显性感染，从而进一步危害蜂群的健康发展[10]。目前，对AmFV的流行性已经有了初步了解，但是有关其致病性、传播性及其与宿主关系的研究还很少。这种DNA病毒究竟如何与宿主相互作用，并且对宿主免疫有何影响，值得进一步深入研究。

致谢

非常感谢韩国安东大学的Chuleui Jung教授提供韩国蜜蜂样本，感谢他在取样过程及部分研究内容方面的建议。