处理猪场沼液的微藻筛选及其净化效果评价

2019-02-28吴逸飞李园成汤江武葛向阳

中国畜牧杂志 2019年2期

孙宏，张恒,2，吴逸飞，沈琦，李园成，汤江武*，葛向阳

（1.浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所，浙江杭州 310021；2.华中农业大学农业微生物国家重点实验室，湖北武汉 430030）

畜禽规模化养殖每年产生大量的养殖污水，特别是经厌氧处理后的沼液仍含有高浓度的氮磷、有机物和重金属等污染物，成为造成水体富营养化的主要因素之一，对自然环境和人类健康造成严重威胁。传统以活性污泥法为基础的生化污水处理工艺虽在沼液处理中发挥了重要作用，但由于沼液碳氮比失衡，仍存在运行不稳定、脱氮除磷效果差等诸多弊端，难以实现污水的资源化利用[1]。

微藻是一类在自然界广泛分布的单细胞生物，能够在光合作用下利用氮磷等营养盐进行同化吸收，实现高效的脱氮除磷作用[2]。同时，微藻细胞内含有油脂、氨基酸、维生素及多种生物活性物质，可用于生产微藻柴油等高附加值产品，从而实现污染物处理和资源化利用相耦合[3-4]。国内外研究表明，利用微藻处理污水的关键是筛选能快速适应特定环境并积累生物量的微藻藻株[5]。目前国内外在应用微藻处理城市生活污水方面已开展了广泛的研究[6-7]，大大降低了微藻培养的成本。但对筛选适宜于畜禽养殖污水，特别是沼液培养和高效生长的微藻研究仍较少[8-9]，并对如何利用微藻改善沼液水质及寻找微藻合适作用条件等方面缺乏系统研究。

本研究通过对猪场沼液中优势微藻的原位筛选分离，生物量、油脂和粗蛋白产率等特征的评价，优选获得适用于沼液处理并具有高生物资源生产潜力的微藻藻株，并探讨不同稀释浓度沼液对该藻株处理效果的影响，以期初步明确合适的作用条件，为其规模化处理工艺的建立提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 微藻的筛选

1.1.1 沼液水质和微藻培养装置试验所用沼液取自浙江安吉吉成牧业有限公司养殖场厌氧发酵塔尾端，化学需氧量（COD）、氨氮、硝酸盐氮、总氮（TN）、总磷（TP）和pH等水质指标见表1。微藻培养装置包括恒温光照培养箱和无菌曝气装置，主要按照试验要求调节温度、光照、曝气量等参数，装置示意图见图1。

表1 猪场沼液的水质指标

图1 微藻恒温光照曝气装置

1.1.2 微藻的富集筛选和纯化对采集的沼液用8层纱布过滤以去除大颗粒物，灭菌后调节pH至7.5，并用无菌水稀释5倍后取200 mL装入500 mL锥形瓶，放置于光照培养箱中无菌曝气培养，光照强度为3 000 lux，温度25℃，曝气强度2.0 L/min。待沼液明显变绿后，在BG-11固体培养基[10]中反复划线分离，置于光照培养箱中培养7 d，随后挑取单藻落继续接入BG-11液体培养基中培养7 d，并再次划线分离得到纯种微藻，同时采用镜检和LB培养基培养鉴定是否存在杂菌污染。

1.1.3 微藻生物量积累及油脂、蛋白质产率评价在微藻培养装置中，初始微藻接种OD680为0.1，每种微藻各3个培养重复，光照强度3 000 lux，温度25℃，曝气强度2.0 L/min培养15 d，期间每隔3 d检测微藻生物量的积累，15 d后8 000 r/min离心收集藻液，真空冷冻干燥后，检测微藻中蛋白和油脂含量并计算产率。

微藻生物量测定采用OD680生物量标准曲线法[7]：通过将纯藻液稀释至OD680为0.1、0.3、0.5、0.7和0.9，各取200 mL并用0.22 μm滤膜收集，100℃烘至绝干后称重，得到OD680和相对应微藻生物量的标准曲线，通过曲线可计算微藻生物量，生物量产率=培养后微藻生物量（g/L）/培养天数（d）。

蛋白含量检测采用凯氏定氮法，油脂含量检测参照Aravantinou等[11]方法通过索氏提取器用石油醚进行萃取后检测。

1.1.4 微藻形态观察及分子鉴定对微藻采用临时制片，对其细胞形态和大小进行初步判断。随后，藻液经8 000 r/min离心收集后，用液氮研磨破壁，然后按照植物基因组抽提试剂盒（DP305，Tiangen）步骤提取总DNA。PCR体系所用引物为EukA（5'-AACCTGGTTG ATCCTGCCAGT-3'）、EukB（5'-TGATCCTTCTGCAG GTTCACCTA-3'）。PCR 体系为 10×transtaq Buffer 5 μL（含有15 mmoL/L的Mg2+），dNTP（2.5 mmoL/L）4 μL，上、下游引物（10 μmoL/L）各0.8 μL，DNA模板2 μL（约30 ng），然后用ddH2O补至50 μL。PCR程序：94℃预变性 4 min；94℃ 变性 45 s，55℃ 退火 45 min，72℃延伸1 min，共31个循环；最后72℃延伸7 min。扩增产物经1.5%（w/v）琼脂糖凝胶电泳检测后，送交生工生物工程（上海）有限责任公司测序。测序得到的18S rDNA序列使用NCBI数据库BLAST程序进行同源性比较分析，应用Clustal X 1.82软件进行序列比对后，通过MEGA 5软件以邻接法构建系统发育树。

1.2 微藻对沼液处理评价

1.2.1 不同微藻对沼液处理能力的比较以灭菌稀释畜禽沼液为培养基，初始微藻接种OD680为0.2，每个试验组设3个平行，其余培养条件同1.1.2，每天取样10 mL微藻培养液于8 000 r/min下离心10 min后收集上清，检测水质指标变化情况。每次取样前补加灭菌去离子水至原刻度线，调节pH至原值。

水质指标检测：COD含量采用《水质化学需氧量的测定-重铬酸盐法》（GB 11914-89），氨氮检测采用《水质氨氮的测定-水杨酸分光光度法》（GB 7481-87），硝酸盐氮含量检测采用《水质硝酸盐氮的测定-紫外分光光度法》（HZ-HJ-SZ-0138），TN含量检测采用《水质总氮的测定-碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法》（GB-11894-89），TP检测采用《水质总磷的测定-钼酸铵分光光度法》（GB 11893-89）。

1.2.2 不同稀释浓度对微藻CS-3降解沼液中污染物的评价对畜禽沼液采用纱布过滤，高温灭菌后，用无菌水进行2倍、4倍和6倍稀释处理，并以不稀释沼液为对照，每个试验组设3个平行，初始微藻接种OD680为0.1，调节pH 7.5～8.0，光照强度3 000 lux，温度25℃，曝气强度为2.0 L/min下培养10 d，每隔2 d取样，3 000 r/min离心10 min后收集上清，测定水样中COD、氨氮、硝酸盐氮、TN、TP和微藻生物量。

1.3 统计分析采用Excel软件进行数据处理，结果以平均值±标准差表示，并采用SPSS 13.0进行单因子方差分析，多重比较采用Duncan's检验，P＜0.05代表差异显著。

2 结果与分析

2.1 微藻的生物量积累及油脂、蛋白质产率评价经过多次富集筛选，获得4株平板形态差异较大的微藻株，分别命名为CS-1、CS-2、CS-3和CS-4。其在BG-11培养基上的生物量积累曲线（图2）表明，除藻株CS-4外，其余3株微藻的生物量均随培养时间的增加而逐渐积累，在15 d时，CS-1、CS-2和CS-3的生物量分别可达到1.49、1.52、1.91 g/L，以CS-3的生物量最高；而藻株CS-4生物量在6 d时达到最高，为0.76 g/L，后随着培养时间延长，生物量逐渐降低。

图2 筛选微藻在BG-11培养基中的生长趋势

筛选微藻在BG-11培养基中生物量、油脂和蛋白质积累情况如表2所示，藻株 CS-3的生物量产率、蛋白产率、油脂产率和细胞内油脂含量均显著高于其余藻株（P＜0.05）；藻株CS-3和CS-4的细胞内蛋白含量显著高于CS-1和CS-2（P＜0.05）。

2.2 目标微藻的生物学鉴定综合微藻在BG-11培养基上的生物量积累及油脂、蛋白质产率情况，筛选出微藻CS-3为最佳藻株。该藻株在BG-11平板上呈深绿色圆形藻落，显微镜下观察直径为4～6 μm，呈球形（图3-A），体积较大。18S rDNA测序结果显示，该株微藻与普通小球藻（Chlorella sorokiniana）相似度最高，达到99%（图3-B）。

图3 小球藻CS-3在显微镜下的单藻形态（A）和基于18S rDNA的系统发育树构建（B）

2.3 不同微藻对沼液处理能力的比较与对照组相比，添加4株微藻均对稀释沼液中的氮磷及COD有较好的去除效果。氨氮方面（图4-A），与对照相比，4株微藻均可在4 d内实现氨氮的完全降解；其中藻株CS-3对硝酸盐氮、TN、TP和COD去除效果最好（图4-B～E），8 d后去除率分别达到94.5%、90.0%、94.8%和46.1%。同时，4株微藻均可在稀释藻液中实现生物量积累（图4-F），在8 d时，微藻CS-3的生物量积累最高，达到1.66 g/L。

2.4 微藻CS-3对不同稀释浓度沼液中污染物降解能力的评价由图5可知，随着沼液稀释倍数的增加，小球藻CS-3的生物量产率明显增加，在6倍稀释沼液中经过10 d的培养，生物量最高为1.31 g/L（图5-A）。沼液中TN、氨氮和硝酸盐氮的去除率随着稀释倍数的增加而增加，在4倍和6倍稀释条件下，经过10 d处理，沼液中氨氮去除率为98.4%和98.2%，TN去除率为96.4%和94.4%；在4倍和6倍稀释条件下，培养4 d后沼液中硝酸盐氮基本完全降解；而在不稀释条件下，硝酸盐氮降解效果差，10 d后降解率仅为52.2%（图5-D）。COD降解方面（图5-E），CS-3对6倍稀释沼液的降解效果最高为56.6%，而对不稀释试验组的COD降解率仅为34.90%。此外，在4倍和6倍稀释浓度下，微藻CS-3对沼液中TP的降解率分别为100%和96.2%（图5-F）。

表2 筛选微藻在BG-11培养基中生物量、油脂和蛋白质积累情况

图4 微藻处理畜禽沼液对污染物指标的影响及其生物量积累变化

3 讨论

图5 小球藻CS-3处理不同稀释倍数猪场沼液后生物量积累和各污染物的降解情况

3.1 微藻生物量的积累和蛋白、油脂产率本研究通过畜禽沼液原位筛选出1株小球藻CS-3，该藻株具有较优异的氮磷去除能力及较高的生物量、油脂和蛋白积累能力，为微藻处理畜禽污水同时藕联生物质资源生产提供了理想藻株。研究表明，自然筛选的微藻在化学合成培养基上培养达到稳定生长期需要9～12 d[12]，本研究所筛选的微藻符合该生长行为。但本试验获得的微藻CS-3的生物量产率、油脂产率分别为0.124 、0.046 g/（L·d），远高于 Abdelaziz等[12]报道的湖泊和河流来源的微藻最高生物量产率0.093 g/（L·d）和油脂产率0.029 g/（L·d）。该结果表明不同来源微藻的生长与油脂积累能力存在差异[13]。本研究中小球藻CS-3的油脂含量与江丽丽等[14]从淡水水体中获得藻株最高达39.7%的油脂含量一致。微藻油脂含量的积累受到培养基内氮素含量的严格调控，当氮素趋于利用完毕时，藻类将倾向于更多地积累油脂成分用以抵御营养缺乏和环境压力[15]。因而，本研究中CS-3的高油脂含量可能与其生物量快速积累后，氮素供给下降有关，需要进一步研究。贺国强等[16]从湖泊等自然水域筛选高油脂产率微藻并进行发酵条件优化后发现，油脂含量可从优化前的20.3%提高到23.2%，油脂产率可从0.324 g/（L·d）提高到 1.233 g/（L·d），表明培养条件优化可进一步提升微藻产油脂能力。除高油脂含量外，CS-3较其余藻株还具有最高的蛋白含量积累。Jebali等[5]所筛选的含油微藻的蛋白含量一般在11.1%～19.1%，显著低于本研究中34.2%的蛋白含量，表明藻株CS-3对污水中的含氮化合物有较强的吸收利用能力，从而进一步提高了其对高含氮污水的净化效果。

3.2 微藻处理沼液的效果目前，采用微藻处理沼液的研究仍较少，主要原因是其生长速率远低于异养微生物，且需要充足的光照和合适的温度、pH和营养盐组成等条件[17]。本研究中藻株CS-3处理稀释沼液较其余藻株具有更优的硝酸盐氮、TN、TP和COD去除效果，去除率分别达到94.5%、90.0%、94.8%和46.1%，且不受沼液中低C/N的限制。该结果优于Wang等[8]采用微藻处理稀释猪场污水后污水总氮（74.6%）和总磷（77.7%）的去除率；也同样高于Aravantinou等[11]报道的微藻处理模拟污水后最高53%的总磷降解率。氮磷去除率的差异可能与藻株不同、污水污染物浓度差异和污水的稀释倍数不同有关[13,16,18]。韩松芳等[7]采用蛋白核小球藻处理城市污水后发现，污水中COD、氨氮、TN、TP的去除率分别可达到81.8%、100%、94.9%和94.2%。值得注意的是，本研究中TN的减少量高于氨氮的去除量，表明微藻利用了除氨氮外的多种氮源进行生长，这与李岩等[19]的报道一致。同时本研究中对照组氨氮含量也有降低，这可能与培养曝气过程中的氮吹脱效应有关，并进一步造成对照组中TN含量也略有降低[20]。由此可知，本试验中微藻对TN的降解可包括2方面的作用，即微藻的吸收转化和氨氮自身的吹脱。本研究中藻株CS-3利用沼液培养后，实现了较高的生物量积累，并与常规培养基BG-11的生物量积累差异不明显，进一步表明藻株CS-3较适合于沼液的处理。此外，研究表明微藻对氨氮浓度较为敏感，但在氨氮降低时，硝酸盐氮对微藻的生长基本无抑制作用[21]，因而藻株CS-3较适用于现有生化污泥处理工艺，如缺氧-好氧工艺的末端，处理含高浓度硝酸盐氮的污水，以实现深度的脱氮和除磷[22]。同时考虑到微藻在生长后期较易沉降，较易实现微藻的回收，进一步降低了微藻后期制备生物柴油的生产成本[23]。

另一方面，氮素是影响微藻生长代谢的重要营养限制因子。本研究中，微藻对氨氮和硝酸盐氮的去除具有明显的先后顺序，表现为优先利用氨氮（氨氮的去除率高），当氨氮在培养4 d利用完后，硝酸盐氮含量开始显著降低。王利燕等[18]研究也表明，藻类吸收利用的氮源主要为氨氮和硝酸盐氮，且以氨氮的利用最为优先。本研究中氮源消耗速度最快的CS-3具有最高的生物量积累和油脂产率，提示CS-3同时利用氨氮和硝酸盐氮进行生长代谢。汪亚俊等[24]研究表明，微藻在氮素降低或受到限制时可短时间内进一步促进藻类的生长，同时增加油脂积累。该具体代谢机制与叶绿体在氮素快速消耗时大量降解以提供藻类细胞生长有关[25]，但仍需进一步研究。

3.3 不同稀释浓度沼液对CS-3降解污染物能力的影响目前，有关不同稀释浓度沼液对微藻培养影响的研究报道较少[18,21]。本研究通过藻株CS-3处理不同稀释倍数的沼液后发现，在稀释倍数较高的条件下（4倍和6倍），微藻脱氮除磷效率和生长情况优异，氮磷去除率均在90%以上，而低稀释倍数的沼液（2倍和不稀释）对CS-3的生长和降解能力有明显的抑制作用。研究表明，沼液不利于微藻生长的主要原因可能包括2个方面：一是沼液中氨氮浓度过高会对微藻有明显的氨抑制和毒害作用，造成微藻老化和同化氮磷能力的减弱进而死亡[26]；二是沼液本身色度过高，不加稀释使用将直接影响微藻正常的光合作用[27]。因此稀释沼液是解决上述问题的有效方式。稀释沼液过程中应考虑稀释对沼液中其他营养元素，如氨基酸、蛋白质和生长激素等的稀释作用，因而需要控制在合适的范围[21]。王利燕等[18]报道，适合小球藻的合适沼液稀释倍数为4倍和8倍。同样有研究报道合适的沼液培藻浓度应至少控制氨氮含量在300 mg/L以下[28]。另一方面，也有研究通过驯化筛选耐高浓度污染物的微藻以提高其处理效率，如Wang等[29]利用紫外线对沼液处理效果较好的2株微藻进行照射并逐步驯化，最终实现了微藻在不稀释的猪场沼液中良好生长，TN和TP去除率分别达到89.5%和85.3%。因此，本研究中微藻CS-3下一步可尝试通过高浓度沼液驯化或采取多轮培养等方式，提高其对沼液的去除效果。